Genetic mechanisms involved in dormancy and flower induction of Fagaceae trees

Abstract

As Fagaceae estão entre as árvores perenes mais importantes a nível económico e ecológico. Durante o inverno, estas árvores entram em estado de dormência de forma a proteger os meristemas e os órgãos primordiais do frio até que se verifiquem condições mais favoráveis à retoma do seu crescimento vegetativo e reprodutivo. Estes ciclos de crescimento/dormência dependem da combinação de respostas complexas a sinais ambientais mediadas por mecanismos reguladores moleculares. Quercus robur (carvalho roble) e Quercus suber (sobreiro) são fagáceas de grande relevância nos países mediterrânicos. Ambas espécies entram em dormência no outono, mantendo os gomos em estado dormente durante o inverno. Na primavera ocorre o abrolhamento nas duas espécies, com as flores monoicas masculinas (amentilhos) a surgirem pouco tempo depois. No entanto, o sobreiro apresenta um fenótipo único entre as fagáceas, uma vez que a sua floração masculina e feminina apresentam ampla separação física e temporal. Isto é, cada evento de floração ocorre com um intervalo de um a dois meses, e não há sinais de abortamento de estruturas reprodutoras do sexo oposto durante todo o desenvolvimento floral. Desvendar os mecanismos genéticos reguladores da dormência e da floração nestas espécies poderá demonstrar-se de grande interesse. Este trabalho visou a identificação e análise da expressão dos potenciais genes reguladores da dormência e floração em Q. robur e em Q. suber durante um ciclo anual de crescimento. Foi desenhado um Yeast One-Hybrid assay para testar a interação entre o gene QsPI e o seu potencial regulador QsHTH. Foi observado que o QrFT é sobrexpresso na fase de crescimento ativo e reprimido durante a dormência sugerindo a conservação do seu papel enquanto libertador da dormência e promotor do crescimento. Foram observados dois picos de expressão dos genes QrSOC1, QrSPL4 e QrSHP, um durante a fase de “bud swelling” e outro antes da indução da dormência, sugerindo duas fases de indução das flores. QrFLC e QrSVP1 registaram um pico de expressão em Outubro, sugerindo a participação destes genes na indução e/ou manutenção da dormência. A sequência codificante do QsHTH foi clonada no pGAD424 e o plasmídeo pAbai contendo parte da sequência do promotor QsPI foi integrado no genoma Y1Gold. Fornecendo, desta forma, todos os componentes necessários para testar a interação entre QsPI e QsHTH num ensaio Y1H. Esta tese proporcionou um útil ponto de vista sobre os mecanismos reguladores da dormência e floração em Q. robur, com importância para futuros estudos e em Fagaceae, e estabeleceu as etapas necessárias para futuras análises da regulação do QsPI e dos mecanismos que controlam a identidade dos sexual das flores.

Fagaceae are amongst the most ecologically and economically relevant perennial tree species. During winter, these trees rely on dormancy to protect their meristems and organ primordia from the cold, until more favorable conditions are met and both vegetative and reproductive growth are resumed. These growth-dormancy cycles are tightly regulated by integration of responses to environmental cues with molecular regulatory mechanisms. Quercus robur and Quercus suber are two Fagaceae of utmost importance in Mediterranean countries, both species enter a dormancy in autumn, with the buds remaining dormant throughout the winter. Usually, in spring bud burst occurs in both species with monoecious flowers emerging shortly after, however, Q. suber flowering phenotype is particular among Fagaceae trees, as Q. suber male and female flowering exhibits a complete temporal and spatial separation, with both flowers being unisexual by inception, and each flowering event occurring one to two months apart. Thus, uncovering the genetic networks regulating dormancy and flowering in these two oak species is of great interest. In this work, identification and expression analysis of potential homologs of Q. robur and Q. suber dormancy and flowering time regulators was performed, and their expression analysis was performed by PCR, during one growing season. Furthermore, an Yeast One-Hybrid assay to test the interaction between B-class MADS-box gene QsPI and its potential regulator QsHTH was designed. QrFT was observed to be differentially overexpressed during phases of active growth and downregulated during dormancy, implying a possible role conservation as a dormancy release and growth promoter. QrSOC1, QrSPL4 and QrSHP were observed to have two expression peaks, one during the buds swelling phase and other in late summer before dormancy induction, possibly indicating two flower induction events. QrFLC and QrSVP1 displayed an expression peak in October, suggesting the involvement of these genes in dormancy induction and maintenance. QsHTH open reading frame was also successfully cloned into the pGAD424 vector, and the pAbai plasmid containing a fragment of QsPI promoter sequence was successfully integrated into the Y1Gold genome. Thus, providing all required components for testing the interaction between QsPI and QsHTH in an Y1H assay. This thesis provided a useful insight into the regulatory mechanisms of dormancy and flowering in Q. robur, which might be useful for future studies focused on other Fagaceae with similar reproductive habits, while setting required steps for further analysis of QsPI regulation, and to a further extent uncover the mechanisms controlling the flowers reproductive organ identity.