Development of a microfluidic device for the isolation of tumour-derived extracellular vesicles

Abstract

Cancro da mama tem sido uma condição recorrente que afecta, sobretudo, a saúde das mulheres globalmente. Mesmo que tecnologia moderna seja capaz de vigiar estes pacientes e tratá-los, reduzindo a taxa de mortalidade, há ainda um atraso no diagnóstico precoce, resultando num aumento da mortalidade geral induzida por metástases. Compreender esta patofisiologia a nível molecular tem sido útil para obter conhecimento sobre a proliferação do cancro, incluindo reincidências. Vesículas extracelulares (VEs) têm sido utilizadas para novas estratégias de deteção de biomarcadores. VEs são secretadas por células e estão presentes no sangue. Estas possuem bicamadas lipídicas contendo no seu interior proteínas, ADNs, ARNs e lípidos bioativos. VEs formam uma grande variedade de mensageiros intracelulares para a comunicação entre vários tipos de células, transportando indicadores de saúde e doença. Entender a diversa composição de VEs tumorais requer ainda investigação de forma a encontrar potenciais biomarcadores clinicamente relevantes. Um dos maiores obstáculos no estudo de VEs é o seu isolamento. Técnicas comuns dependem, em geral, de estratégias de ultra-centrifugação, que costumam consumir muito tempo e inerentemente obtêm baixos rendimentos. Recentemente, o reagente ExoGAG foi introduzido como um método alternativo para executar o enriquecimento de VEs, permitindo o seu isolamento de biópsias líquidas e obtendo uma população pura de VEs. Para além disto, dispositivos microfluídicos, que manipulam fluídos a altos rácios de fluxo, têm mostrado resultados promissores no isolamento de VEs com poucas contaminações. Especificamente, micromisturadores poderão ser usados para ampliar a produção de complexos VE-ExoGAG, num microssistema, aumentando a eficácia da coleção de VEs. Este projecto pretende desenvolver um sistema microfluídico capaz de misturar VEs com ExoGAG, com o âmbito em obter uma amostra pura para o diagnóstico do cancro da mama. O micromisturador “espinha de peixe escalonada” obteve os melhores resultados de misturação. Técnicas de caracterização mostraram níveis significativos da conjugação, porém a obtenção de populações monodispersas coesas mostrou-se uma tarefa difícil.

Breast Cancer has been a recurring condition that affects, especially, the health of many women worldwide. Even though modern technology has been able to monitor these patients and apply treatment, reducing the mortality rate, early diagnosis still lags, resulting in an overall cause of morbidity induced by cancer metastasis. Understanding this pathophysiology, at a molecular level, has been promising to grant knowledge about breast cancer proliferation, including relapses. Extracellular vesicles (EVs) have been used for new biomarker detection strategies. EVs are secreted from cells and can be found in blood circulation. They possess lipid bilayers containing in their interior proteins, DNAs, RNAs, and bioactive lipids. EVs form a vast array of intracellular messengers that are used for communication between a variety of cell types, carrying signals of both health and disease. Understanding the diversity of the composition of tumour EVs requires further investigation to unveil their potential as clinically relevant biomarkers. One of the biggest challenges for the study of EVs has been their isolation. Current techniques mostly rely on ultracentrifugation strategies, which are generally time-consuming and also inherently provide a low yield. Recently, the ExoGAG reagent has been introduced as an alternative method to streamline EV enrichment allowing their isolation from liquid biopsies, and obtaining a purified EV population. Moreover, microfluidic devices, which manipulate fluids at high flow rates, have recently shown promising EV isolation results with low contaminations. Specifically, micromixers can be used to enhance the generation of EV ExoGAG complexes, in a microsystem, increasing the efficiency of EV collection. This project aims to develop a microfluidic device capable of mixing EVs with ExoGAG to obtain a purified sample for breast cancer diagnosis. A staggered herringbone mixer has shown to be the most optimal for mixing efficiency. Characterization analysis showed a significant conjugation of ExoGAG with EVs, although cohesive monodispersed populations were difficult to obtain.