Molecular interactions within an antagonistic module of protein involved in plant developmental processes

Abstract

The protein-protein interactions (PPIs) underlying the interplay between plant transcription factors (TFs) have not been studied in detail; however, understanding their interaction is important to unravel Gene Regulatory Networks. The Antirrhinum majus asymmetric flower development involves the proteins DIVARICATA (DIV), RADIALIAS (RAD) and DIV-and-RAD interacting factor (DRIF) working in the tug-of-war DIV-DRIF-RAD (DDR) regulatory module. It functions as an on/off molecular switch, in which DIV and DRIF can interact in a DNA-binding complex; RAD can sequester the DRIF in the cytoplasm, preventing the establishment of the DIV-DRIF complex. The module has been co-opted into different functions across several species. In Arabidopsis thaliana it is unclear whether the DDR homologous proteins work as a module, despite previous work showing involvement of individual genes in the control of several molecular processes. One of the aims of this work was to characterize the expression of the DDR genes in tissues and conditions in A. thaliana to unveil a possible involvement of the DDR regulatory module during development, as well as in the response to abiotic stresses and in the regulation of hormone signalling. Another aim of the work was to obtain recombinant protein to in the future perform biophysical assays to further characterize the molecular mechanism through which RAD antagonizes the DIV function by establishing a complex with the DRIF protein. Only AmRAD1 was previously expressed and purified. In this work, the conditions for the expression of soluble AmDIV1, MpDIV1, and AtDRIF3 were optimized. The last aim of the work was to determine the amino acid residues that establish PPI between AmRAD and AmDRIF binding through in silico analysis of the AmRAD1 crystal structure and the AmDRIF1 MYB simulated structure. Some AmRAD1 residues potentially involved in PPI were tested through site-directed mutagenesis and by yeast two-hybrid assays. The identified residues were utilized to restrict the simulated models of interaction between the AmRAD1 and AmDRIF1 structures. The results from this work will take us closer to understanding the DDR module by identifying new processes in which it is involved. It will also take us closer to understanding the RAD-DRIF and DIV-DRIF complexes, which may be used to fine tune the module into a system for graded expression, which would allow the regulation of the phenotype associated with the module.

As interações proteína-proteína (IPPs) subjacentes à interação entre fatores de transcrição (FTs) de plantas não foram estudadas em detalhe; no entanto, entender a interação é importante para desvendar Redes Regulatórias Genéticas. O desenvolvimento assimétrico da flor de Antirrhinum majus envolve as proteínas DIVARICATA (DIV), RADIALIAS (RAD) e fator de interação DIV-e-RAD (DRIF) a trabalhar no módulo “tração à corda” DIV-DRIF-RAD (DDR). Funciona como um interruptor molecular no qual DIV e DRIF podem formar um complexo de ligação a DNA; o RAD consegue sequestrar o DRIF no citoplasma, impedindo a formação do complexo DIV-DRIF. O módulo foi cooptado para diferentes funções em várias espécies. Em Arabidopsis thaliana não está claro se as proteínas homólogas de DDR funcionam num módulo, apesar de trabalhos anteriores mostrarem o envolvimento de genes individuais no controlo de vários processos moleculares. Um dos objetivos deste trabalho foi caraterizar a expressão dos genes em tecidos e condições em A. thaliana para desvendar um possível envolvimento do Módulo DDR durante o desenvolvimento, bem como na resposta a stresses abióticos e na regulação da sinalização hormonal. Outro objetivo do trabalho foi obter proteína recombinante para no futuro se realizarem ensaios biofísicos para caracterizar o mecanismo molecular pelo qual o RAD antagoniza a função do DIV estabelecendo um complexo com a proteína DRIF. Apenas AmRAD1 foi previamente expresso e purificado. Neste trabalho, as condições para a expressão de AmDIV1, MpDIV1 e AtDRIF3 foram otimizadas. O último objetivo do trabalho foi determinar resíduos aminoácidos que estabelecem a ligação IPP entre AmRAD e AmDRIF através da análise in silico da estrutura cristalina de AmRAD1 e da estrutura simulada do MYB de AmDRIF1. Alguns resíduos de AmRAD1 potencialmente envolvidos em IPP foram testados por mutagénese sítio-específica e por ensaios com o sistema de duplo-híbrido. Os resíduos identificados foram utilizados para restringir os modelos de interação simulados entre as estruturas AmRAD1 e AmDRIF1. Os resultados deste trabalho nos aproximem da compreensão do módulo regulatório do DDR, identificando novos processos nos quais o módulo está envolvido. Também nos aprofundará o entendimento dos complexos RAD-DRIF e DIV-DRIF, que poderá ser usado para ajustar o módulo num sistema de expressão gradual, o que permitiria a regulação do fenótipo associado ao módulo.