Analysis of epigenetic regulators in sperm cells from patients with male infertility

Abstract

A infertilidade é uma doença que afeta cerca de 15 % dos casais em todo o mundo, dos quais 20 a 30 % devem-se a um fator masculino. Atualmente, cerca de metade dos casos de infertilidade masculina ainda são idiopáticos, no entanto, o aumento da pesquisa aponta para alterações epigenéticas. Estas alterações cujas funções regulatórias incluem a metilação do DNA, regulada pelas metiltransferases do DNA, e a hidroximetilação do DNA, um intermediário da desmetilação do DNA regulado pelas enzimas TET. Alterações epigenéticas já foram encontradas em células de espermatogénese, com possíveis implicações na expressão de genes-alvo e foram ainda associadas a oligozoospermia. No nosso estudo, o principal objetivo passa por avaliar as alterações dos reguladores epigenéticos em espermatozóides de pacientes inférteis com oligozoospermia, essenciais durante a espermatogénese e embriogénese na reprogramação epigenética. Realizou-se um PCR quantitativo em tempo real para avaliar os níveis de transcritos dos seis reguladores epigenéticos (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, TET1, TET2 e TET3). Paralelamente, a expressão proteica foi analisada por imunofluorescência e Western Blot, juntamente com a análise das alterações de DNA, 5mC e 5hmC. Foi possível identificar a significativa subexpressão de DNMT1 e DNMT3A em pacientes inférteis, concordante com uma tendência de diminuição de marcação celular e uma correlação significativa positiva entre a expressão relativa ou os níveis relativos de proteína e a concentração de espermatozoides. DNMT3B e TET3 apresentaram uma diminuição não significativa nos níveis de mRNA, coincidente com uma diminuição em células DNMT3B-positivas juntamente com uma correlação positiva entre os níveis relativos de proteína DNMT3B e a concentração de espermatozóides. Nenhuma alteração foi observada nos níveis de mRNA de TET1 e TET2 e correlações, nem no número de células positivas de 5hmC. Todavia, células 5mC-positivas aumentaram nas amostras oligozoospérmicas. Embora preliminares, os nossos resultados apoiam a associação da desregulação epigenética, especialmente das proteínas DNMT e TET, com a infertilidade masculina e fundamentam a necessidade de uma investigação mais aprofundada para identificar seu potencial para o desenvolvimento de tratamentos, avaliar a viabilidade do esperma e possíveis implicações em tratamentos de fertilidade.

Infertility is a condition that affects around 15 % of couples worldwide, with 20 to 30 % being due to a male factor. Currently, about half of the cases of male infertility are still idiopathic although the increasing research points to epigenetics modifications. These regulatory modifications include DNA methylation, regulated by DNA methyltransferases, and DNA hydroxymethylation, an intermediate of DNA demethylation regulated by TET enzymes. Epigenetic modifications have been found in spermatogenic cells possibly causing abnormal expression of target genes and were also associated with oligozoospermia. In our study, we aimed to assess epigenetic regulators modifications in sperm cells from infertile patients with oligozoospermia, essential during spermatogenesis and embryogenesis in epigenetic reprogramming. Quantitative Real-Time PCR was performed to evaluate transcript levels of the six epigenetic regulators (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, TET1, TET2 and TET3). Additionally, protein expression was analysed by immunostaining and Western Blot together with analysis of 5mC and 5hmC DNA modifications. We were able to identify DNMT1 and DNMT3A significant underexpression in infertile patients, in accordance with a tendency to decrease cell staining and a significant positive correlation between either relative expression or relative protein levels and sperm concentration. DNMT3B and TET3 showed a non-significant decrease in mRNA levels, with a concomitant decrease in DNMT3B-positive cells along with a positive correlation between relative DNMT3B protein levels and sperm concentration. No changes were observed in TET1 and TET2 mRNA levels and correlations as well as in the number of 5hmC-positive cells. However, 5mC-positive cells were increased in oligozoospermic samples. Although preliminary, our results support the association of epigenetic deregulation, especially of DNMT and TET proteins, with male infertility and warrant further investigation to identify their potential for developing treatments, assessing sperm viability and possible implications in fertility treatments.