Granules for treatment of intestinal bacterial infections

Abstract

Diarrheal diseases are estimated to cause millions of deaths annually, primarily among children under five years old living in low- and middle-income countries. The intestinal pathogenic Escherichia coli (InPEC) is one of the major responsible agents for these diseases worldwide. This pathogen not only causes diarrheal disease but is also responsible for other medical problems like haemorrhagic colitis and haemolytic uremic syndrome. For a full recovery and a complete pathogen eradication, a specific antibiotic regimen (usually three doses per day for five days) should be taken. This is particularly difficult when administering to small children, as they cannot swallow tablets and often refuse multiple doses. Hence, this project focused on developing two granulated intestinal release systems (slow and fast) allowing for a single daily administration. The drug release from the granules should only start when it reaches the intestine to allow the full dose to reach the infection site and promote the continuous release of the antibiotic (levofloxacin) at bactericidal concentrations for extended period of time. The granule matrixes incorporated Generally Regarded as Safe (GRAS) excipients with functions of diluents, binders and disintegrants as well as an enteric polymeric coating. The granules were prepared using a wet granulation methodology and evaluated in terms of antimicrobial activity, release, stability and cytotoxicity. The optimization of the granular formulation led to the production of a fast-release system - batch loaded-K – and slow-release systems – batches loaded-L. Both systems were used for drug release evaluation in order to assess the release profile obtained under colonic simulated environment. The fast-release formulation released all drug content after 15 min of dissolution testing. As for the slow-release formulation, the dissolution profile indicated to be dependent on the concentration of the matrix component HPMC K4M: the higher the excipient concentration, the slower the release of the drug from the matrix. Loaded-K batch was evaluated for stability, antimicrobial activity and cytotoxicity. This formulation proved to exhibit an identical dissolution profiling after 5 shelf-months. On a biological level, this formulation exhibited a visible inhibitory effect against E. coli bacteria. Furthermore, this batch was tested for cytotoxicity profiling on Caco-2 cells and red blood cells. In conclusion, loaded-K formulation demonstrated a non-toxic profile towards intestinal epithelial cells and erythrocytes, indicating an overall safety of this formulation while maintaining the antibacterial activity of loaded levofloxacin.

As doenças diarreicas estimam-se responsáveis por milhões de mortes anualmente, especialmente em crianças até cinco anos de idade residentes em países subdesenvolvidos. Escherichia coli intestinal patogénica (InPEC) é um dos principais agentes responsáveis por estas doenças, mundialmente. Este patogeno não só causa doenças diarreicas, mas também outras complicações clínicas, tais como colite hemorrágica e síndrome hemolítica-urémica. Atualmente, a erradicação completa do patogeno e total recuperação do paciente é conseguida através de um regime específico de antibióticos (usualmente três doses por dia, para cinco dias). Deste modo, o tratamento é um desafio quando administrado em crianças, dada a resistência à toma de comprimidos orais e em múltiplas doses. Este projeto focou-se no desenvolvimento de dois sistemas granulares de libertação intestinal (lento e rápido), que permita uma só administração diária. A libertação do fármaco deverá ser iniciada apenas no intestino e promover a contínua libertação do antibiótico (levofloxacina) em concentrações bactericidas. A matriz dos grânulos é composta por excipientes Geralmente Reconhecidos como Seguros (GRAS) com funções como diluentes, aglutinantes e desintegrantes, bem como por um revestimento polimérico entérico. Os grânulos foram produzidos por um processo de granulação húmida e avaliados para: libertação de fármaco, estabilidade, atividade antimicrobiana e citotoxicidade. A otimização da formulação levou à produção de um sistema de libertação rápida – lote loaded-K – e um sistema de libertação controlada – lote loaded-L. Ambas as formulações foram avaliadas pelo seu perfil de libertação de fármaco em condições colónicas simuladas. O sistema de libertação rápido apresentou uma libertação total do fármaco em 15 min. Já o sistema de libertação controlada mostrou ser dependente da concentração de HPMC K4M presente na matriz: quanto maior a concentração, mais lenta a libertação do fármaco. O lote loaded-K foi, ainda, avaliado para estabilidade: após 5 meses de armazenamento a formulação não apresentou diferenças significativas no perfil de libertação de fármaco. A um nível biológico, esta formulação exibiu efeitos inibitórios visíveis contra bactérias E. coli. Além disso, foi ainda testada o perfil citotóxico em células Caco-2 e eritrócitos. Em suma, a formulação loaded-K demonstrou um perfil não tóxico em células epiteliais intestinais e eritrócitos, sugerindo o uso seguro desta formulação nas concentrações bactericidas testadas.