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https://hdl.handle.net/1822/80448
Título: | A cold-adapted subtilisin-like serine protease: production, purification and application |
Outro(s) título(s): | Uma subtilase serina protease adaptada ao frio: produção, purificação e aplicação |
Autor(es): | Gonçalves, Ricardo Daniel Gavina |
Orientador(es): | Collins, Tony Kristjánsson, Magnús Már |
Palavras-chave: | Otimisação de produção Projeto composto central Substrato insolúvel VPRp Production optimisation Central Composite Design Insoluble substrate |
Data: | 28-Jan-2020 |
Resumo(s): | VPRp é uma subtilase serina protease isolada da bactéria gram-negativa psicrofílica Vibrio
sp. PA-44. Devido a partilhar homologia com proteinase K, possui o potencial para uma ampla
especificidade de substratos. Tais características sugerem um elevado potencial para uso em
várias aplicações, entre as quais a decomposição eficiente de biomassa rica em proteínas.
Atualmente, esta protease é produzida em E. coli por produção batch e o presente estudo objetivou
otimizar o processo de produção batch e avaliar o papel das principais variáveis do processo na
produtividade de VPRp. Além disso, a proteína foi purificada e investigada para uso na quebra de
um substrato de proteína insolúvel. Estudos preliminares de vários meios e seus componentes
sugeriam 2xYT como o meio de escolha devido à compatibilidade com cálcio, conforme necessário
para a estabilidade de VPRp e altos níveis de produção. Para otimização do processo de produção,
uma técnica estatística multivariada, nomeadamente, metodologia de superfície de resposta (MSR)
com um projeto composto central (PCC), foi aplicada para desenho experimental, modelagem
estatística, avaliação do modelo aplicado, avaliação de variáveis de processo e identificação das
condições do processo para produção máxima de VPRp. Os efeitos das variáveis de processo:
concentração de IPTG, tempo de indução e período de indução foram estudados e um modelo
quadrático com um valor de p <0,01 foi aplicado para descrever o conjunto de dados e prever a
variável de resposta. O tempo de indução e o período de indução mostraram-se críticos para a
produção de VPRp. Utilizando o modelo quadrático, as condições ótimas das variáveis do processo
foram identificadas como indução com 1,35 mM de IPTG a 15,2 h de incubação durante um
período de indução de 34,4 h. Um protocolo de purificação de três etapas foi desenvolvido para
purificar VPRp produzido intracelularmente e possibilitou a obtenção de 217 mg de protease pura
por litro de cultura de produção. Uma investigação comparativa da atividade de VPRp na
solubilização de substrato de proteína insolúvel indicou maior atividade com esta enzima em
comparação com três proteases comerciais. Foi 1,7 vezes mais ativa que a sua homóloga
mesofílica proteinase K sob as condições de temperatura moderada (25 °C) utilizadas, enquanto
as outras proteases demonstraram apenas atividade residual ou nenhuma atividade. Tais
observações são promissoras para estudos futuros. VPRp is a subtilisin-like serine protease isolated from the psychrophilic gram-negative bacterium Vibrio sp. PA-44 and characterised by a high activity at low to moderate temperatures and, due to homology to proteinase K, potentially a broad substrate specificity. Such attributes indicate its potential for use in various applications, among which is the efficient breakdown of protein rich biomass. Presently, this protease is produced in E. coli by batch production and the current study aimed to optimise the batch production process and evaluate the role of key process variables in VPRp productivity. In addition, the protein was to be purified and investigated for use in the breakdown of an insoluble protein substrate. Preliminary investigations of various media and media components suggested 2xYT as the medium of choice due to compatibility with calcium, as required for VPRp stability, and high VPRp production levels. For optimisation of the production process, a multivariate statistical technique, namely, response surface methodology (RSM) with a central composite design (CCD), was employed for experimental design, statistical modelling, evaluation of the applied model, evaluation of process variables and identification of process conditions for maximum VPRp production. The effects of the process variables: IPTG concentration, time of induction and induction period were studied and a quadratic model with a p-value of < 0.01 applied to describe the dataset and predict the response variable. The time of induction and induction period were shown to be critical for VPRp production. Using the quadratic model, the optimum process variable conditions were identified as induction with 1.35 mM IPTG at 15.2 h incubation for a 34.4 h induction period. An abridged three-step purification protocol was developed to purify intracellularly produced VPRp and enabled the obtention of 217 mg of pure protease per litre of production culture. A comparative investigation of VPRp activity in solubilising an insoluble protein substrate indicated highest activity with this enzyme as compared to three commercial protease preparations. It was 1.7-fold more active than its mesophilic homolog proteinase K under the moderate temperature (25 °C) conditions used, while the other proteases only demonstrated residual or no activity. Such observations show promise for future studies and may be resultant of the high activity cold adapted characteristics of VPRp combined with a broad substrate specificity. |
Tipo: | Dissertação de mestrado |
Descrição: | Dissertação de mestrado em Genética Molecular |
URI: | https://hdl.handle.net/1822/80448 |
Acesso: | Acesso aberto |
Aparece nas coleções: | BUM - Dissertações de Mestrado DBio - Dissertações de Mestrado/Master Theses |
Ficheiros deste registo:
Ficheiro | Descrição | Tamanho | Formato | |
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