Development and implementation of laboratory methodologies to study microbial multicellular communities

Abstract

As leveduras, tal como outros microrganismos, são geralmente consideradas unicelulares. No entanto, na natureza, os microrganismos vivem mais frequentemente em agregados multicelulares, onde milhões de células se organizam e multiplicam, formando biofilmes. Tal como nos tecidos dos Eucariontes superiores, um biofilme requer a produção de uma matriz extracelular (MEC) que fornece organização espacial, disponibilidade de nutrientes e água, promove a diferenciação celular e aumenta a tolerância do microrganismo a compostos antimicrobianos ou biocidas. Consoante a espécie e as condições ambientais, a composição da MEC microbiana varia, embora contenha sempre polissacarídeos e proteínas e, por vezes, lípidos e DNA. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver e implementar três procedimentos experimentais para o estudo da MEC de leveduras: (i) otimizar um protocolo de extração de MEC para a eficiente deteção e quantificação de compostos por HPLC ao longo do desenvolvimento do biofilme; (ii) implementar o sistema de separação eletroforética de glucosaminoglicanos, para análise dos polissacáridos que compõem a MEC; e (iii) desenvolver um dispositivo para a fácil observação do comportamento invasivo e da capacidade de proliferação ao longo do tempo de formação de biofilme. Para o efeito foram usadas várias estirpes de Saccharomyces cerevisiae, e pontualmente de Candida albicans. O protocolo de extração de MEC foi adaptado para permitir a deteção e quantificação de metabolitos por HPLC. Estes metabolitos foram analisados ao longo do desenvolvimento de um biofilme do tipo "tapete" e também durante diferentes tempos de incubação de MEC num ambiente livre de células. Os resultados sugerem que a MEC contém, como esperado, metabolitos que pertencem às principais vias metabólicas de levedura, como etanol e glicerol, bem como os ácidos fracos associados ao ciclo do TCA e outras vias. O caminho está aberto para o estudo detalhado da composição da MEC como um produto do metabolismo celular e das enzimas presentes na MEC. Além disso, a separação dos glucosaminoglicanos da MEC de levedura por eletroforese foi alcançada com sucesso. Para isso, uma tina foi construída e um protocolo que permite a reprodução dos resultados previamente publicados foi implementado. Finalmente, foi desenhado e construído um dispositivo que permite o estudo do comportamento invasivo das células e a sua capacidade de proliferação associada à formação de biofilme. Permite avaliar a diferenciação/filamentação ao longo do tempo, incluindo a estimativa da velocidade de crescimento das hifas.

Yeasts, as other microorganisms are generally regarded as unicellular. However, in nature, they most often live in multicellular aggregates, where millions of cells stick together and multiply forming a biofilm. As it happens in the tissues of higher Eukaryotes, a biofilm requires a self-produced extracellular matrix (ECM) that provides a scaffold for spatial organization, nutrient and water availability, promotes cellular differentiation and enhance the microorganism tolerance to antimicrobial compounds or biocides. The composition of the microbial ECM varies depending on the species and environmental conditions, though it always contains polysaccharides, proteins, and sometimes lipids and DNA. The present work aimed to develop and implement three experimental procedures that can be used for the study of yeasts ECM: (i) define an ECM extraction protocol adapted for the efficient detection and quantification of key metabolites by HPLC along biofilm development; (ii) the implementation of a glycosaminoglycan agarose diaminopropane electrophoresis system to analyse the polysaccharidic fraction of the ECM; and (iii) the development of a device that allows the easy observation of invasive behaviour, and proliferation ability associated with biofilm formation along time. The work used Saccharomyces cerevisiae strains and occasionally also Candida albicans’. The adaptation of an ECM extraction protocol was done to allow the detection and quantification of metabolites by HPLC. These were analysed along the development of biofilm-like mats and in an ECM cell-free environment along time. Results suggest that the ECM harbours, as expected, metabolites that belong to the main cellular metabolic backbone as ethanol and glycerol, as well as the weak acids associated with TCA cycle and other pathways. The way is open for the detailed study of the composition of the ECM as a product of both cell metabolism and the many enzymes present in the ECM. Furthermore, the separation of the yeast ECM glycosaminoglycans by electrophoresis was successfully achieved. For that purpose, a tank was built, and a protocol was implemented allowing the reproduction of previously published results. Finally, a device was designed and built that allows the study of the cells’ invasive behaviour and the proliferation capacity associated with biofilm formation. It enables the assessment of differentiation/filamentation along time, including the estimation of the velocity at which the hyphae grow.