Validation of sensitivity and specificity of triplet-primed PCR (TP-PCR) in the molecular diagnosis of FRAXE

Abstract

Em rotina, a determinação do tamanho da região repetitiva GCC do gene AFF2 inclui análise baseada em PCR e em Southern blot (SB) sendo esta última uma metodologia cara e demorada. Por isso, noutros genes, o SB está a ser substituído por outras alternativas como o Triplet-repeat primed PCR (TP-PCR). Quanto sabemos, este método nunca foi aplicado ao diagnóstico de FRAXE. A síndrome do XE frágil (FRAXE) é uma forma moderada de défice intelectual associada a défice de aprendizagem, hiperatividade e em casos raros, comportamentos autistas. FRAXE, com uma frequência estimada de 1/50000, é uma doença associada a repetição de tripletos causada pela expansão do tripleto GCC em 5’UTR do gene AFF2. O amplo e inespecífico espectro clínico de FRAXE faz com que testes moleculares sejam essenciais para um diagnóstico definitivo. Neste trabalho, um novo TP-PCR foi desenvolvido usando um primer com ligação antes das repetições, um primer (GCC)5 com cauda, que também se liga a uma segunda região em AFF2,e um primer idêntico à cauda inespecífica. O ensaio foi otimizado e validado recorrendo a sete amostras com tamanho de alelos conhecidos. Amostras de ADN de 500 mulheres com um PCR de rotina não informativo também foram testadas. Primeiramente, o ensaio determinou corretamente o tamanho dos alelos em 475 amostras com um genótipo de GCC na faixa normal. Nas restantes 25 amostras originalmente genotipadas como homoalélicas, o ensaio determinou 19 com alelos na faixa normal, quatro alelos intermédios e duas pré-mutações. De entre o grupo de 19, quatro foram incorretamente genotipadas devido a um T>C SNP na região próxima das repetições (validado por sequenciação de Sanger). Este SNP também foi identificado em homozigotia numa amostra. Para verificar o tamanho correto das repetições nas amostras com resultados discrepantes, estas foram analisadas por PCR de rotina e Southern blot sendo que, a presença de alelos expandidos, foi confirmada. Descrevemos então uma ferramenta simples, precisa e específica que pode ser usada para determinar o número de repetições (até 100 repetições) em alelos do gene AFF2. O ensaio identificou as amostras homoalélicas de forma inequívoca evitando a necessidade de uma segunda técnica demorada e representando uma alternativa atrativa para laboratórios de diagnóstico. Além disto, o ensaio identificou seis amostras com alelos expandidos que são putativamente patogénicos e instáveis representando um valor acrescentado no diagnóstico molecular de FRAXE.

Routinely, the sizing of the AFF2 gene GCC repetitive region includes PCR-based and Southern blot (SB) analyses, the latter being a very expensive and time-consuming methodology. For that reason, in other genes, SB is being replaced by alternative approaches such as triplet-repeat primed PCR (TP-PCR). To the best of our knowledge, this method has never been applied to the diagnosis of FRAXE. Fragile XE syndrome (FRAXE) is a form of mild to moderate intellectual disability associated with learning deficits, hyperactivity as well as autistic behaviour in rare cases. FRAXE, with an estimated frequency of 1/50000, is a trinucleotide repeat disease mostly caused by a GCC expansion in 5’UTR of the AFF2 gene. The broad and unspecific spectrum of FRAXE clinical presentation makes molecular testing essential for a definitive diagnosis. Herein, a novel TP-PCR was developed using a primer binding upstream the repeat, a (GCC)5- tail primer, also binds to a second region within AFF2, and a primer identical to the unspecific tail. The assay was optimized and validated resorting to seven samples with known allele sizes. DNA samples from 500 unrelated females with a previous uninformative routine PCR testing result were further tested. Firstly, the assay correctly sized 100% of the alleles in 475 samples with a normal-range GCC genotype. In the remaining 25 samples originally genotyped as homoallelic, our assay determined 19 with alleles within the normal range, four intermediate alleles and two premutations. Among the first group of 19, four had been incorrectly genotyped due to a T>C SNP near the repetitive region (validated by Sanger sequencing), this SNP was also identified in homozygosity in one sample. To verify the correct repeat length in the discrepant samples, they were additionally analysed by routine PCR and SB and the presence of the expanded alleles was confirmed. We describe a simple, accurate and specific tool that can be used to determine AFF2 alleles up to 100GCC repeats. The assay unambiguously identified homoallelic samples often obviating the need of a second, usually time-consuming technique and representing an attractive alternative for diagnostic laboratories. Furthermore, in six samples this assay correctly identified a putatively pathogenic and unstable expanded allele which had escaped detection with the previously performed PCR representing an added value in the molecular diagnosis of FRAXE.