Studies on apoptosis regulation: the role of N-terminal acetylation and the N-degron pathways

Abstract

N-terminal (Nt)-acetylation has arisen as a highly multifunctional protein modification. The eight currently known eukaryotic N-terminal acetyltransferases (NATs) mediate Nt-acetylation of a wide range of proteins, resulting in the Nt-acetylome. NatB, composed of the catalytic subunit Naa20 and the auxiliary subunit Naa25, is after NatA the second major contributor to the Nt-acetylome. In spite of the well-known role of NatB-mediated Nt-acetylation on biological processes, such as actin cytoskeleton and cell proliferation, its impact on apoptosis is still poorly elucidated, in particular regarding its effect on protein stability and degradation through the recognition of specific residues at the N-terminus. Herein, we sought to assess the impact of NatB-mediated Nt-acetylation on apoptosis regulation. We show that inactivation of the NatB catalytic subunit Naa20 in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) reduces the Nt-acetylation of about one third of the identified NatB substrates. As the inactivation of Naa20 is unable to eliminate Nt-acetylation of NatB substrates, another enzyme or paralog likely fills its absence. Moreover, Naa20-/- MEFs exhibit a significant reduction in protein levels of procaspase-8, -9, -3 and of Bid, associated with a decreased susceptibility to etoposide and TNF-a plus SMAC/DIABLO mimetics that, in this later case, was partially reverted by silencing the E3 ubiquitin protein ligase UBR4, a N-recognin of the Arg/N-degron pathway. We also show through an in silico systematic search that the main apoptotic components are NATs and N-recognins substrates, suggesting a complex interplay between Nt-acetylation and degradation by N-degron pathways with a relevant impact on apoptosis modulation. Additionally, a novel yeast-based system to study Bax regulation under conditions mimicking its function in the cellular context, was developed. Cell death in response to acetic acid was reverted by Bcl-xL, but not by its truncated form Bcl-xLAC. Yet, in the absence of NatB-mediated Nt-acetylation, Bax was unstable, and though Bcl-xL protects Bax from degradation it does not protect cells from the loss of plasma membrane integrity. Altogether, the work developed brought novel insights supporting the relevance of NatB-mediated Nt-acetylation for cellular proteostasis and proper function of apoptosis.

A acetilação N-terminal tem surgido como uma modificação proteica altamente multifuncional. As oito acetiltransferases (NATs) atualmente conhecidas em eucariotas medeiam a acetilação de uma vasta gama de proteínas no seu N-terminal, resultando no acetiloma. A NatB, composta pela subunidade catalítica Naa20 e pela subunidade auxiliar Naa25, é a seguir à NatA, a que mais contribui para o acetiloma. Apesar do seu conhecido papel em vários processos celulares, como o citoesqueleto de actina e proliferação celular, o seu impacto na apoptose está ainda pouco elucidado, em particular o seu efeito na estabilidade e degradação de proteínas através do reconhecimento de resíduos específicos no seu N-terminal. Nesta tese, procurámos avaliar o impacto da acetilação N-terminal mediada pela NatB na regulação da apoptose. Dado que a inativação da Naa20 em fibroblastos embrionários de rato (MEFs) reduziu apenas para cerca de um terço a acetilação do N-terminal dos substratos da NatB identificados, outra enzima ou parálogo deve colmatar a sua ausência. Além disso, Naa20-/- MEFs exibiram uma redução significativa nos níveis de procaspase-8, -9 e -3 e de Bid, associada a uma diminuição da suscetibilidade das células ao etoposídeo e TNF-cL suplementado com SMAC/DIABLO que, neste último caso, foi parcialmente revertida através do silenciamento da E3 ubiquitin ligase UBR4, uma N-recognina da via de degradação Arg. Através de uma pesquisa sistemática in silico, mostrámos que os principais componentes das vias apoptóticas são substratos das NATs e das N-recogninas, suportando uma relação complexa entre a acetilação N-terminal e a degradação pelas vias N-degron com impacto na modulação da apoptose. Foi ainda desenvolvido um sistema para estudar a regulação de Bax na levedura em condições que mimetizam a sua função em contexto celular. A morte celular em resposta ao ácido acético foi revertida pela Bcl-xL, mas não pela Bcl-xLAC. Contudo, na ausência de acetilação mediada pela NatB, Bax mostrou-se instável e, embora a Bcl-xL proteja Bax da degradação, não protege as células da perda de integridade da membrana plasmática. Resumindo, o trabalho trouxe novos conhecimentos que suportam a importância da acetilação mediada pela NatB na proteostase celular e correto funcionamento da apoptose.