Novel enzymes for the agro-food industries

Abstract

Enzymes are biological catalysts that accelerate the rate of chemical reactions in cells and are commonly used in a range of industries. They can improve the efficiency, cost-effectiveness and environmental impact of many processes and enhance the characteristics and quality of products. New enzymes with novel backbone sequences and novel functions and characteristics are constantly called for. In the present project, 116 yeasts from mainly acidic pH biowastes, 11 aquatic filamentous fungi from cold environments in Portugal and Iceland, 3 bacterial isolates and 3 metagenomic clones from Irish soil samples were screened for the production of glycoside hydrolase enzymes of industrial interest, namely xylanases, cellulases, pectinases and chitinases. Methods were investigated and developed for a simplified screening of the various isolates at 16 ºC, pHs 4, 7 and 9, with, in particular, the development of a novel xylanase substrate. The substrate was shown to be suitable for measurement of xylanase activity with the commonly used DNS assay but further tests with other xylanases are recommended to confirm this. Furthermore, the substrate was successfully coupled with remazol brilliant blue (RBB) dye, obtaining a chromogenic substrate and enabling a highly sensitive and efficient plate based screening of xylanases. Screening of the CBMA culture collection isolates allowed for identification of a large number of glycoside hydrolase positive isolates, with 31 isolates showing desired activities exclusively at acidic pH. These enzymes may be of interest for use in various applications and, in particular, in food and beverages applications. In addition, 5 isolates were found to display all 4 activities screened for at pH 4, and these isolates may have potential for use in biomass treatment applications. A cellulase positive metagenomic clone with metagenomic DNA from Irish soil was selected for further analysis. The gene for this cellulase was successfully amplified and digested with restriction enzymes but attempts at ligation in an expression vector and transformation to an E. coli expression host proved unsuccessful within the time scope of the project. Further studies should be focused on overexpressing and characterising this novel enzyme.

As enzimas são catalisadores biológicos que aceleram reações químicas, sendo usadas diariamente numa ampla gama de indústrias, promovendo a melhoria da eficiência de processos, da relação custo eficiência, assim como o impacto ambiental, para além de melhorar as características e a qualidade do produto. Há uma constante demanda por novas enzimas, de sequências, funções e características inovadoras. Neste projeto, 116 leveduras, maioritariamente provenientes de bio-resíduos acídicos, 11 fungos filamentosos de ambientes frios em Portugal e Islândia, 3 isolados bacteriais e 3 clones metagenómicos de amostras de solo Irlandês foram usados num rastreio por enzimas glicosil hidrolases de interesse industrial, nomeadamente, xilanases, celulases, pectinases e quitinases. Métodos para um rastreio simplificado dos vários isolados a 16 ºC, a pH 4, 7 e 9, foram investigados e desenvolvidos, tendo-se em particular, desenvolvido um novo substrato de xilanase. Este substrato demonstrou, através do ensaio DNS, ser apropriado para a medição de atividade xilanolítica, mas testes com outras xilanases são necessários para obter confirmação. Adicionalmente, este substrato foi ligado com sucesso ao corante remazol brilliant blue (RBB), obtendo-se um substrato cromogénico, possibilitando um rastreio de xilanases, em placas, altamente sensível e eficiente. O rastreio dos isolados da coleção de culturas do CBMA permitiu a identificação de um grande número de isolados positivos para a presença de glicosil hidrolases, em que 31 demonstraram atividade exclusivamente a pH acídico. Estas enzimas podem ser de interesse para uso em várias aplicações, particularmente na indústria alimentar. Adicionalmente, 5 isolados mostraram ter atividade para todas as enzimas rastreadas a pH 4, podendo ter um potencial uso no tratamento de biomassa. Um clone metagenómico, com ADN metagenómico de solo Irlandês, positivo para atividade celulolítica, foi selecionado para análise adicional. O gene desta celulase foi amplificado com sucesso por PCR e digerido com enzimas de restrição apropriadas, mas tentativas de ligação num vetor de expressão e transformação para hospedeiro de expressão E.coli não foram bem sucedidas dentro do tempo limite do projeto. Estudos futuros deverão concentrar-se em expressar e caracterizar esta nova enzima.