Development of a new approach to control otitis media pathogens

Abstract

Otitis media is one of the most common illnesses in childhood and the leading cause for an antibiotic prescription. Endolysins, peptidoglycan hydrolases encoded by bacteriophages, are an attractive antibiotic alternative. Their transtympanic delivery directly to the middle ear would maximize bioavailability, reducing the probability of a recurrent or chronic infection. However, the tympanic membrane acts as a barrier, preventing the diffusion of molecules from the ear canal to the middle ear. Delivery systems with permeation enhancing characteristics would allow surpassing this barrier and, at the same time, provide sustained and targeted delivery. Therefore, the main goal of this work was to develop a novel delivery system for a non-invasive transtympanic treatment of otitis media using endolysins. For this, four objectives were addressed: i) identification of the bacterial pathogens causing otitis media in middle ear fluid samples collected in Braga, Portugal; ii) characterization of endolysins active against otitis media pathogens; iii) encapsulation of endolysins for a controlled delivery; iv) evaluation of the transtympanic permeation ability of the developed formulation. Pathogens in middle ear fluid samples collected from children with otitis media were identified by culture and quantitative polymerase chain reaction. Haemophilus influenzae was the most prevalent pathogen, followed by Streptococcus pneumoniae. Endolysins against both pathogens were identified, but only the endolysin from the S. pneumoniae phage MS1 (MSlys) was successfully expressed. MSlys exhibits high specificity towards S. pneumoniae, killing different otitis media isolates and showing promising antimicrobial properties against planktonic and biofilm cells. The MSlys endolysin was encapsulated into deformable liposomes composed of L-alpha-lecithin and sodium cholate (L:SC:MSlys) or PEG2000 PE (L:PEG:MSlys) with an average efficiency of about 35%, being released in a sustained manner over time. Furthermore, the MSys-loaded liposomes showed no cytotoxicity against fibroblast and keratinocyte cell lines and interacted with S. pneumoniae cells. Ex vivo transtympanic permeation studies showed that PEGylated liposomes significantly increased the transport of MSlys through the tympanic membrane compared to its free form and maintained antipneumococcal activity after the initial permeation time points. Nevertheless, degradation of MSlys occurred after an extended incubation period at 37 ºC, which consequently affected its antimicrobial effectiveness. In summary, endolysin-loaded PEGylated liposomes are a promising approach for transtympanic treatment of otitis media. Nonetheless, further optimization is required to expand the overall therapeutic efficacy of this novel strategy to control otitis media pathogens.

A otite média é uma das doenças mais comuns na infância e a principal causa de prescrição de antibióticos. As endolisinas, hidrolases do peptidoglicano codificadas por bacteriófagos, são uma atrativa alternativa aos antibióticos. A sua entrega transtimpânica diretamente para o ouvido médio aumentaria a biodisponibilidade, reduzindo a probabilidade de uma infeção recorrente ou crónica. No entanto, a membrana timpânica atua como uma barreira, impedindo a difusão de moléculas do canal auditivo para o ouvido médio. A utilização de sistemas de entrega de fármacos permitiria ultrapassar esta barreira, providenciando uma libertação controlada e direcionada. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi desenvolver um novo sistema de libertação para o tratamento transtimpânico e não-invasivo da otite média, utilizando endolisinas. Para tal, quatro metas foram estabelecidas: i) a identificação das bactérias causadoras de otite média em amostras de fluído do ouvido médio recolhidas em Braga, Portugal; ii) a caraterização de endolisinas com atividade contra bactérias patogénicas da otite média; iii) a encapsulação de endolisinas para uma libertação controlada; iv) a avaliação da capacidade de permeação transtimpânica da formulação desenvolvida. As bactérias patogénicas presentes em amostras de fluído do ouvido médio de crianças com otite foram identificadas por técnicas de cultura e reação em cadeia da polimerase quantitativa. Haemophilus influenzae foi identificada como a bactéria mais prevalente, seguindo-se a Streptococcus pneumoniae. Foram identificadas endolisinas contra estas bactérias, mas apenas a endolisina codificada pelo bacteriófago de MS1 (MSlys) foi expressa com sucesso. Esta exibiu especificidade contra S. pneumoniae, atuando contra isolados de otite média, e mostrando-se eficaz na redução de células planctónicas e biofilmes. A endolisina MSlys foi encapsulada em lipossomas deformáveis compostos por L-alfa-lecitina e colato de sódio (L:SC:MSlys) ou PEG2000 PE (L:PEG:MSlys), com uma eficiência de cerca de 35%, sendo libertada de forma controlada. Os lipossomas carregados com a endolisina não apresentaram citotoxicidade contra fibroblastos e queratinócitos. Ensaios ex vivo mostraram que os lipossomas PEGuilados aumentam significativamente o transporte da MSlys através da membrana timpânica, reduzindo os níveis de células de S. pneumoniae. No entanto, observou-se uma degradação da endolisina após um período prolongado de incubação a 37 ºC, afetando a sua eficácia antimicrobiana. Em suma, este trabalhou mostrou que lipossomas PEGuilados contento endolisinas são promissores para o tratamento transtimpânico da otite média. No entanto, esta formulação requer otimização e ensaios adicionais para se constituir uma alternativa terapêutica.