Generation of molecular tools for the expression and trafficking analyses of human monocarboxylate transporters

Abstract

Most cancer cells rely on glycolysis to sustain their high proliferation rates with the production of lactate. For many years, lactate was seen as a metabolic waste of glycolytic metabolism in the tumor microenvironment, however, lactate has been recently associated as a key metabolic fuel and as an important signaling molecule. This substrate is responsible for extracellular acidification, which, is a feature of the tumor environment, and favors tumor invasion. The transport of lactate across the plasma membrane is mediated by a family of proton coupled monocarboxylate transporters (MCTs), which comprises 14 members. MCT1 and MCT4 serve as metabolic links between cancer cells via lactate exchange within tumors. This form of metabolic symbiosis illustrates how the apparent waste product from hypoxic tumor cells may be exploited by oxidative tumor cells to sustain their energy production under nutrient deprived conditions. MCTs are not only gatekeepers of intercellular metabolic cooperation, but also important regulators of angiogenesis and tumor migration, invasion, and metastasis. However, the role of MCTs in tumors is far from being well understood and their potential as therapeutic targets is poorly explored. Given the relationships between MCT1 and MCT4 in cancer cells, they offer a unique opportunity for novel treatment strategies. In this work, a set of molecular tools was generated for the expression and trafficking analyses of MCT1 and MCT4 transporters. Plasmids were designed harboring MCT1 or MCT4 genes with GFP or mCherry at their 3’- or 5’- ends, following the classical DNA cloning method. These molecular tools will be essential to study the expression and localization of MCT1 and MCT4 and to investigate the conditions and mechanisms underlying the endocytic trafficking of both transporters in tumor cells. Additionally, these constructs can be used for colocalization or interaction studies, with advanced techniques like FRET.

A maioria das células cancerígenas depende da glicólise para sustentar altas taxas de proliferação através da produção de lactato. Durante muito tempo, o lactato foi visto como um resíduo metabólico da glicólise no microambiente tumoral, no entanto, recentemente, esta molécula foi destacada como um combustível metabólico chave e uma molécula sinalizadora crucial. O lactato é responsável pela acidificação extracelular, característica do ambiente tumoral e que favorece o crescimento e a invasão das células tumorais. O transporte de lactato através da membrana plasmática, é mediado por uma família de transportadores de monocarboxilatos (MCTs), acoplados a protões que inclui 14 membros. MCT1 e MCT4 estabelecem ligações metabólicas entre as células cancerígenas por meio da troca de lactato. Esta forma de simbiose metabólica ilustra como o produto residual aparente de células tumorais hipóxicas pode ser explorado por células tumorais oxidativas para sustentar a produção de energia sob condições de privação de nutrientes. Os MCTs não são apenas guardiões da cooperação metabólica intercelular, mas também reguladores importantes da angiogénese e da migração, invasão e da metastização. No entanto, o papel dos MCTs no cancro está longe de ser bem compreendido e o seu potencial como alvos terapêuticos é pouco explorado. A relação entre MCT1 e MCT4 em células cancerígenas, oferece, portanto, uma oportunidade única para novas estratégias terapêuticas para o cancro. Deste trabalho, resultou um conjunto de ferramentas moleculares relevantes para o estudo da expressão e análise do tráfego dos transportadores, MCT1 e MCT4. Foram construídos 8 plasmídeos com as sequências dos genes MCT1 ou MCT4 fundidas com os genes que codificam as proteínas fluorescentes, GFP ou mCherry, nas extremidades 3’ ou 5’ dos MCTs, seguindo o método clássico de clonagem de DNA. Essas ferramentas moleculares serão essenciais para estudar a expressão e localização desses transportadores e para avaliar as condições e mecanismos subjacentes ao tráfego endocítico dos transportadores, MCT1 e MCT4, em células tumorais. Além disso, estes plasmídeos podem ser usados para estudos de co-localização ou estudos de interação, com técnicas avançadas como FRET.