Particle-based system for keratinocyte growth factor release in skin models

Abstract

Wound re-epithelialization is a dynamic process that comprises the formation of new epithelium through an active signaling network between several growth factors and various cell types. The main players are keratinocytes (KCs) that migrate from the wound edges to reestablish a continuous epithelium to ultimately restore epidermal barrier. One of the most important molecules involved in this process is Keratinocyte Growth Factor (KGF) since it is central on promoting both migration and proliferation of KCs. Stromal cells, like dermal fibroblasts, are the main producers of this factor, acting on KCs through paracrine signaling. Multiple strategies to delivery KGF, envisioning therapeutic application, have been proposed to boost wound healing by targeting re-epithelialization. In this thesis, two different systems were explored: gellan gum (GG) KGF-loaded particles and human adipose stem cells (hASCs) cell sheet constructs as foreseen units for controlled KGF production and consistent release. In the first one, the optimization of the release assays with a model molecule showed that in polydisperse particles less protein was entrapped, and the further lyophilization allowed a significantly higher release of the molecule. Moreover, after entrapment with the optimized conditions, KGF was released in a controlled way exhibiting different release profiles dependent on the pH used. The particles were internalized when in contact with human keratinocytes (hKCs) and lead to their significantly higher proliferation and migration. The neutralization of KGF reduced the migration, confirming the KGF-dependent stimulation effect on cellular migration. In the second strategy, hASCs were able to produce KGF in culture, in opposition hKCs alone. In co-cultures of hKCs with hASCs, in form of cell sheets and cell suspension, KGF was also present and a mitogenic/motogenic effect on hKCs was observed. Additionally, by neutralizing KGF in vitro, a strong inhibition on migration was revealed, confirming that the direct stimulatory effect of KGF on hKCs improved migration. Taking all together, the explored KGF-based systems showed to impact hKCs migration and mitogenic activity, opening the opportunity to treat wounds with impaired re-epithelialization.

A re-epitelização de feridas é um processo dinâmico que compreende a formação de um novo epitélio através de uma rede de sinalização ativa entre diversos fatores de crescimento e tipos celulares. Os principais intervenientes são os queratinócitos (KCs) que migram desde as margens das feridas de modo a restabelecer um epitélio continuo para, por fim, restaurar a barreira da epiderme. Uma das moléculas mais importantes deste processo é o Fator de Crescimento de KCs (KGF), uma vez que é fundamental para promover a migração e a proliferação destas células. Células estromais, como os fibroblastos da derme, são os principais produtores deste fator, atuando nos KCs através de sinalização parácrina. Diversas estratégias para a entrega deste fator têm sido propostas para melhorar a cicatrização de feridas através da re-epitelização, tendo como objetivo a sua aplicação terapêutica. Nesta tese foram explorados dois sistemas diferentes: partículas de gellan gum (GG) com KGF e cell sheets de células estaminais humanas do tecido adiposo (hASCs), como unidades produtoras de KGF. Na primeira abordagem, a otimização dos ensaios de libertação com uma molécula modelo mostraram que em partículas polidispersas foi encapsulada menos proteína, e que uma liofilização posterior permitiu que a libertação da molécula fosse significativamente maior. Após o encapsulamento do KGF nas condições previamente otimizadas, os perfis de libertação controlada foram diferentes, consoante o pH. Em contacto com KCs humanos (hKCs), as partículas foram internalizadas e demonstraram um efeito na proliferação e migração significativamente maior destas células. A neutralização do KGF reduziu a migração dos hKCs, confirmando o efeito estimulatório dependente de KGF. Na segunda estratégia, as hASCs mostraram ser produtoras de KGF em cultura, ao contrário dos hKCs sozinhos. Em co-culturas de hKCs com hASCs (cell sheet ou suspensão celular), foi também detetada a presença de KGF, assim como o efeito mitogénico/motogénico nos hKCs. Além disso, ao neutralizar o KGF in vitro, uma forte inibição na migração foi observada, confirmando que o efeito estimulatório direto do KGF na melhoria da migração dos hKCs. Resumindo, os sistemas explorados baseados em KGF mostraram ter impacto na migração e na atividade mitogénica de hKCs, podendo ser explorados no tratamento de feridas em que re-epitelização é insuficiente.