Insights into the role of biocides in the performance of activated-sludge process focusing on the filamentous populations

Abstract

O impacto ambiental relacionado com o uso de vários produtos químicos antimicrobianos (biocidas) na prática geral e em ambientes domésticos e industriais está na ordem do dia. A explosão de produtos antimicrobianos para lavagem de mãos e limpeza de superfícies é um bom exemplo da disseminação do uso de biocidas nos últimos anos. Estes têm uma contribuição significativa nos impactos das atividades humanas no meio ambiente e na saúde, principalmente relacionados com a seleção de estirpes resistentes a antibióticos. O processo de lamas ativadas é o tipo de tratamento biológico mais utilizado para remover poluentes de águas residuais em todo o mundo devido às suas vantagens económicas. Diferentes tipos de microrganismos (bactérias, fungos e protozoários) estão envolvidos no processo de depuração das águas residuais. As bactérias correspondem a cerca de 95 % do total da comunidade microbiana presente nas lamas ativadas, sendo as principais responsáveis pela degradação de substâncias orgânicas das águas residuais. As bactérias filamentosas são componentes normais da biomassa das lamas ativadas; no entanto, o seu crescimento excessivo pode causar problemas na sedimentação das lamas (bulking filamentoso) e na formação de espumas (foaming filamentoso) reduzindo a eficiência das estações de tratamento de águas residuais (ETAR). Nesta tese de doutoramento, foi explorada uma nova abordagem para a potencial influência de biocidas sobre o desempenho global de processos de lamas ativadas, abordando-se o uso de biocidas como potenciais compostos de controlo das populações de bactérias filamentosas esclarecendo, simultaneamente, o impacto desses produtos químicos nas comunidades biológicas de uma ETAR. Inicialmente, foi realizado um estudo de 16 ETAR Portuguesas de lamas ativadas, de forma a melhorar o conhecimento dos parâmetros ambientais que determinam a composição e a prevalência da comunidade filamentosa no tanque de arejamento. Um total de 22 morfotipos filamentosos foram identificados. O Tipo 1851 foi o morfotipo mais frequentemente dominante, seguido por Microthrix parvicella e os Tipos 0092 e 0041/0675. Estes também foram os morfotipos dominantes durante as ocorrências de bulking filamentoso. Foram obtidas correlações significativas entre a abundância de bactérias filamentosas e os parâmetros ambientais, mas a análise estatística multivariada apenas confirmou a correlação negativa entre o Tipo 0092 e o Índice Volumétrico de Lamas (IVL), enfatizando a associação deste organismo filamentoso com o bulking. Numa segunda fase, foi avaliado o efeito in-vitro do triclosano [0.25 a 200 μg/mL], do brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB) [1 a 40 μg/mL] e do glutaraldeído [40 a 1000 μg/mL] em duas bactérias filamentosas, Nocardia amarae (Gram positiva) e Sphaerotilus natans (Gram negativa). Os resultados mostraram um efeito “dose-dependente” na viabilidade bacteriana e diferentes mecanismos de ação. Além disso, diferenças na suscetibilidade à exposição de cada biocida sugeriram um efeito “estirpe-dependente”. Todos os biocidas causaram fragmentação dos filamentos em células dispersas, perdendo-se também, por isso, a capacidade de produzir flocos. Após a remoção do biocida, as células permaneceram dispersas, e mesmo as bactérias viáveis não foram capazes de produzir novos filamentos em 48 horas. Entre os biocidas testados, o CTAB apresentou o maior efeito biocida, seguido do triclosano e glutaraldeído para N. amarae, mas no caso de S. natans, a ordem entre os dois primeiros inverteu-se, apresentando-se o triclosano como o mais tóxico. Finalmente, foram conduzidos ensaios à escala laboratorial, de forma a avaliar os efeitos biocidas, utilizando amostras de lamas ativadas reais (simulando uma ETAR real), a fim de compreender as mudanças na comunidade microbiana num cenário mais complexo. Os resultados permitiram avaliar o efeito dos biocidas tanto na comunidade microbiana como nos parâmetros de desempenho das unidades de lamas ativadas estudadas. O efeito biocida foi percetível desde o início do ensaio no caso do triclosano (na concentração de 2 mg/g MLSS) e do CTAB e do glutaraldeído (a partir da concentração de 10 mg/g MLSS). As duas bactérias filamentosas dominantes mostraram reações diferentes aos biocidas: a Gram negativa Tipo 0092 demonstrou ser claramente mais resistente do que a Gram positiva Tipo 0041/0675. Conclui-se que a adição de biocidas originou fragmentação de bactérias filamentosas em células dispersas, perda de estrutura dos flocos (menor densidade). Em termos globais, foi demonstrado que é possível aproveitar a presença de biocidas no desempenho global dos processos de lamas ativadas, particularmente no controlo do bulking filamentoso, desde que monitorizados os parâmetros de avaliação do processo, bem como o desempenho geral e estudos iniciais sejam realizados levando em consideração as bactérias filamentosas mais problemáticas.

The environmental impact related to the use of antimicrobial chemicals (biocides), in general practice and in domestic and industrial settings, is in the order of the day. The explosion of antimicrobial hand-wash and cleaning products in recent years is a paradigmatic example of the increasing use of biocides. It is well known that their use has a significant contribution to the environmental and health impacts, mainly related with the selection of antibiotic-resistant strains. The activated-sludge process is the most widely used type of biological treatment to remove pollutants worldwide, mainly due to its economic advantages. Different types of microorganisms (bacteria, fungi and protozoa) are involved in the wastewater processing and cleaning. Bacteria sum up around 95 % of the total microbial community of the activated-sludge, being responsible for most of the degradation of organic substances in the wastewater. Filamentous bacteria are normal components of activated-sludge biomass but their excessive growth leads to potential problems mainly on the sludge settling (filamentous bulking) or in the formation of scums (filamentous foaming), thus reducing the efficiency of the wastewater treatment plants (WWTP). In this thesis, a new approach to the potential influence of biocides on the overall performance of activated-sludge processes was explored, addressing the use of biocides as potential control compounds of the filamentous bacteria populations, but also aiming at clarifying the impact of these chemicals in the biological communities of WWTP. At first, a study of 16 Portuguese activated-sludge WWTP was carried out to improve the understanding of the environmental parameters determining the composition and prevalence of the filamentous community in the aeration tank. A total of 22 filamentous morphotypes were identified. Type 1851 was the most frequently dominant morphotype, followed by Microthrix parvicella and Types 0092 and 0041/0675. These were also the dominant morphotypes during bulking occurrences. Significant correlations were obtained between the abundance of filamentous bacteria and environmental parameters, but multivariate statistical analysis only confirmed the negative correlation between Type 0092 and sludge volume index (SVI), emphasizing the association of this particular filamentous organism with bulking. In a second phase, the in-vitro effect of triclosan [0.25 to 200 μg/mL], cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) [1 to 40 μg/mL] and glutaraldehyde [40 to 1000 μg/mL] on two filamentous bacteria, Nocardia amarae (Gram positive) and Sphaerotilus natans (Gram negative), was assessed. The results showed a dose-dependent effect on bacterial viability and different action mechanisms. Moreover, differences in susceptibility to exposure of each biocide suggested a strain-dependent effect. All biocides led to morphological modification of the filaments leading to their fragmentation to single cells. Therefore, the ability to enhance floc formation through the filament skeleton was also lost. After biocide removal, the morphology remained as single cells, even in viable bacteria, which were not able to produce new filaments in the next 48 h. Among the biocides tested, CTAB was found to present the highest biocidal effect, followed by triclosan and glutaraldehyde for N. amarae, whereas for S. natans, the ranking of toxicity was triclosan, CTAB and glutaraldehyde. Finally, bench-scale assays were conducted to evaluate biocide global effects using samples of real activated-sludge (mimicking a real WWTP). Simultaneously the performance of the plants was assessed. The results allowed to infer the effect of biocides both in the microbial community and in the performance of activated-sludge units. The biocidal effect was perceptible since the very beginning of the assay for triclosan at the lowest concentration (2 mg/g MLSS), but for CTAB and glutaraldehyde, the effect was only noticeable at the concentration of 10 mg/g MLSS. The two dominant filamentous bacteria, Type 0092 and 0041/0675, showed different susceptibility to the biocides and, in this case, the Gram negative Type 0092 was clearly more resistant then the Gram positive Type 0041/0675. It was also possible to infer that the biocides addition gave rise to fragmentation of filamentous bacteria into single cells and loss of floc structure (lower density). In global terms, it has been shown that it is possible to take advantage of the presence of these biocides in the overall performance of activated-sludge processes, particularly in the filamentous bulking control, as long as the other components and overall performance are monitored and initial studies are accomplished taking in consideration the problematic filamentous bacteria.