Characterization and development towards electrochemical real-time LAMP detection in an integrated and portable device

Abstract

Nos últimos anos os biossensores eletroquímicos têm sido reportados como uma abordagem promis sora para a deteção de DNA. São atrativos para dispositivos point-of-care pela facilidade de miniaturização, compatibilidade com técnicas de microfabricação e facilidade de instrumentação. Contudo, a integração de uma fase de amplificação com a deteção de sinais continua a ser um desafio. A técnica LAMP (loop mediated isothermal amplification ) surgiu como solução, destacando-se pela sua robustez e sensibilidade. Uma plataforma portátil para deteção eletroquímica de DNA (Mobi-E) foi desenvolvida para incorporar as caraterísticas mencionadas. Neste trabalho foram caraterizados os principais componentes do disposi tivo: potencióstatos ASIC, controlo de temperatura e um chip fluídico que integra elétrodos e estruturas de aquecimento impressas. Seguidamente, efetuou-se uma pesquisa para funcionalização universal desses elétrodos utilizando MD LAMP (mediator displacement LAMP). O desempenho do potencióstato, especificamente a rotina de voltametria de onda quadrada e a leitura quase simultânea dos 6 elétrodos de trabalho de uma câmara, foi provado e comparado com um dispositivo comercial, obtendo-se resultados qualitativamente comparáveis. Foram ainda realizadas otimizações para estabilização do potencial de referência, através da conversão Ag/AgCl por FeCl3, e para precaver dificuldades de medição resultantes da limitada tensão de conformidade do potencióstato (1.8 V). Para tal, aumentou-se a área do elétrodo auxiliar, através da impressão de 8 camadas de Au (4 no elétrodo de trabalho), e efetuou-se, entre medições, o curto-circuito entre o elétrodo auxiliar e o de referência. O sistema de controlo de temperatura provou ser efetivo no aquecimento das câmaras até 65 ºC em 2.5 min e na monitorização assertiva das suas temperaturas. Não foi detetado cross-talk entre câmaras vizinhas, nem a formação severa de bolhas de ar. Como prova de conceito, foram testadas quatro abordagens para MD LAMP e foi identificada uma alternativa promissora (Stem-Loop ) ao standard, com a respetiva mudança relativa de sinal: 0.3 e 177.6. Esta dissertação culmina com a otimização da reação LAMP para uma libertação eficiente do medi ador. Duas promissoras combinações de concentrações de mediador, primer modificado e loop primer foram identificadas: 200 nM, 400 nM, 400 nM e 100 nM, 200 nM, 600 nM, respetivamente, obtendo-se uma relação sinal/ruído de 3.7 e 2.9. Os conhecimentos adquiridos viabilizam o avanço da investigação no sentido da obtenção de um dispositivo capaz de realizar LAMP eletroquímico em tempo real.

Electrochemical biosensors have been reported in recent years as a promising approach for DNA detection. The ease of miniaturization, compatibility with microfabrication techniques and simple instru mentation make these sensors attractive for point-of-care (POC) devices. However, integrating an ampli fication stage with signal detection remains a challenge. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has emerged as a robust and highly sensitive isothermal strategy. A novel portable platform for rapid electrochemical DNA detection (Mobi-E device) was developed to incorporate the aforementioned features. Within this work, an extensive characterization of the main components of the Mobi-E device, which comprises ASIC potentiostats, temperature control, and a fluidic chip with integrated inkjet-printed electrodes and heating structures, was performed, followed by a research towards target-independent electrode functionalization employing mediator displacement (MD) LAMP. The operation of the general functionalities of the ASIC potentiostat, specifically the square wave voltammetry (SWV) routine and the quasi-simultaneous read-out of all 6 working electrodes (WEs) of a chamber, was proven and its performance was benchmarked against a commercial device, achieving qualitatively comparable results. Inherent optimizations of the device were performed to stabilize the reference electrode (RE) potential, through Ag/AgCl conversion by FeCl3, and to address the criticality that the 1.8 V compliance voltage of the potentiostat brought to the measurements. For this issue, it is suggested to increase the counter electrode (CE) area by printing 8 Au layers (WE with 4 layers) and to short-circuit the CE and RE between measurements. The temperature control system proved to be effective in heating the chambers to 65 ºC in about 2.5 min and assertively monitoring their temperature. Furthermore, no cross-talk between neighbouring chambers and no severe bubble formation was detected. Four concepts for target-independent MD LAMP were tested as proof-of-concept and a promising alternative (”Stem-Loop universal reporter (UR)”) to the standard approach was identified. The following relative signal change was achieved: 0.3 and 177.6, respectively. This thesis culminates with the optimization of fluorescent LAMP reaction parameters towards an efficient mediator release. Two promising concentration combinations of mediator, modified primer (LB_Medc) and loop primer (LB) were identified: 200 nM, 400 nM, 400 nM and 100 nM, 200 nM, 600 nM, respectively. For these, the signal-to-noise ratio was 3.7 and 2.9. The knowledge acquired in this thesis allows moving forward towards a device able to perform electrochemical real-time LAMP readout.