Unraveling the role of lymphotoxin signaling in T-cell acute leukemia molecular crosstalk with microenvironmental cells

Abstract

The tumor microenvironment influences the initiation and progression of hematological malignancies. However, relatively little is known about the identity and function of microenvironmental factors participating in T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) development. T-ALL is an aggressive malignancy, fatal without early diagnosis and therapy, affecting mainly children and adolescents, and with poor prognosis upon relapse. In T-ALL patients, malignant cells may occur in distinct microenvironmental niches such as blood, bone marrow (BM), and lymphoid organs. Such niches and molecular factors there produced are likely important for maintenance and disease progression, but so far only a few microenvironmental factors have been shown to favor T-ALL progression in mice, such as interleukin 7 and certain chemokines. Transgenic mice expressing the TEL-JAK2 fusion protein develop T-ALL with short latency and full penetrance. It was found that TEL-JAK2 leukemic cells express lymphotoxin (LT) proteins from the early stages of the disease 1. Supporting the notion that lymphotoxin promotes leukemogenesis, it was found that genetic inactivation of the LTβ receptor (LTβR) in TEL-JAK2 mice impaired T-ALL development 1. These results suggested that LT mediates molecular crosstalk between malignant and stromal non-malignant cells, thus favoring leukemogenesis. Therefore, we aimed to understand how LTβR activation in stromal cells can facilitate T-cell leukemogenesis. To this end, we tested a hypothesis: lymphotoxin-expressing leukemic cells activate LTβR signaling in stromal cells. To test this hypothesis, we co-cultured LT-expressing leukemic cells with fibroblast (NIH3T3) or BM-derived stromal (MS-5) cell lines stably transduced with a lentiviral construct expressing a luciferase reporter gene under control of an NF-kB-responsive transcriptional promoter. We found that leukemic cells activated the NF-kB reporter in transduced MS-5 cells and NIH3T3 fibroblasts, and confirmed that these cell line express LTβR. Next, we observed that luciferase activity in co-cultures was blocked by LTβR-Fc, a soluble inhibitory protein, thus showing that NF-kB activation was indeed mediated through LTβR stimulation. In addition, NF-kB reporter induction by cocultured leukemic cells was impaired in LTβR gene-deficient mouse embryonic fibroblasts. In conclusion, LT-expressing leukemic cells can indeed activate LTβR signaling in neighboring stromal cells. Considering these results, we will in the future identify LTβR-dependent transcriptional programs induced in stromal cells by leukemic cells.

O microambiente tumoral influencia a iniciação e a progressão de doenças malignas hematológicas. Contudo, sabe-se relativamente pouco sobre a identidade e a função de fatores microambientais que participam no desenvolvimento da leucemia linfoblástica aguda de linfócitos T (LLA-T). A LLA-T é uma doença maligna agressiva, fatal na ausência de diagnóstico precoce e terapia apropriada, que afeta principalmente crianças e adolescentes e tem mau prognóstico após recidiva. Nos pacientes LLA-T, as células malignas podem se encontrar em nichos microambientais distintos, como o sangue, a medula óssea e os órgãos linfáticos. Estes nichos e fatores moleculares produzidos por eles serão importantes para a manutenção e progressão da doença, mas até agora apenas alguns fatores microambientais demonstraram favorecer a progressão de LLA-T em murganhos, como por exemplo a interleucina 7 e certas quimiocinas. Murganhos transgénicos que expressam a proteína de fusão TEL-JAK2 desenvolvem LLA-T com latência rápida e penetrância completa. Verificou-se que as células leucémicas TEL-JAK2 expressam proteínas linfotoxina (LT) desde os estadios iniciais da doença 1. Indicando que a linfotoxina promove a leucemogénese, observou-se que a inativação do gene codificante do recetor da LT-β (LTβR) em murganhos TEL-JAK2 aumentou a latência de desenvolvimento de LLA-T 1. Estes resultados sugerem que a linfotoxina medeia a comunicação molecular entre células malignas e células não malignas do estroma, favorecendo assim a leucemogénese. No seguimento destes resultados, o nosso objetivo foi compreender como a ativação de LTβR nas células do estroma pode facilitar a leucemogénese dos linfócitos T. Para este fim, testamos uma hipótese: as células leucémicas que expressam linfotoxina ativam a sinalização LTβR nas células estromais. Afim de testar esta hipótese, co-cultivamos as células leucémicas que expressam LT com linhas celulares derivadas de estroma da medula óssea (MS-5) ou fibroblásticas (NIH3T3), previamente transduzidas de forma estável com uma construção lentiviral que expressa um gene repórter de luciferase sob o controle de um promotor transcricional responsivo a NF-kB. Assim, verificámos que as células leucémicas ativaram o repórter NF-kB em células MS-5 e fibroblastos NIH3T3, e confirmámos que estas linhas celulares que expressam LTβR. Em seguida, observámos que a atividade de luciferase em co-culturas foi bloqueada por uma proteína inibidora solúvel (LTβR-Fc), mostrando assim que a ativação de NF-kB foi de fato mediada pela estimulação de LTβR. Além disso, a indução do repórter de NF-kB por células leucémicas cocultivadas foi diminuída em fibroblastos embrionários de murganho deficientes do gene codificante do LTβR. Em conclusão, as células leucémicas que expressam LT podem de facto ativar a sinalização LTβR em células estromais vizinhas. Considerando estes resultados, de futuro iremos identificar programas de transcrição dependentes de LTβR induzidos em células de estroma por células leucémicas.