Generating a personalized immunotherapy by reprogramming fibroblasts to regulatory T cells

Abstract

For a long time, cell development was thought to be a unidirectional process. Cellular identity is acquired and maintained through the expression of lineage specific transcription factors (TFs). Several studies starting in mid 19s that culminated in the complete reversion of a somatic cell to a pluripotent state with defined TFs by Shinya Yamanaka in 2006 demonstrated that cell fate could be altered and modelled at ones will. Direct cell reprogramming began to be seen an alternative strategy for the generation of autologous cells for regenerative medicine. Immune tolerance is an important process of a healthy individual to control unwanted immune responses against the self, food, environmental allergens and innocuous commensal microbiota. Regulatory T cells (Tregs) are one of the evolutive mechanisms the organism has to promote homeostasis. In autoimmune diseases, Tregs are dysfunctional and patients may benefit from a immunotherapy based on these cells. Until now, direct reprogramming of fibroblasts to Tregs has not been attempted. In this study, we have established a strategy to induce Treg cell fate in fibroblasts. First, literature mining and computational analysis were employed to identify candidate TFs to induce Tregs. Twenty-one candidate TFs were selected based on their restricted gene expression in Tregs and implication in Treg developmental specification and function. Secondly, candidate TFs were individually cloned in a doxycycline-inducible lentiviral vector. Thirteen TFs have been used to transduce transgenic FoxP3-GFP mouse embryonic fibroblasts (MEFs). These cells harbour a Foxp3-GFP fusion protein under the control of the endogenous FoxP3 promoter. This reporter system allowed the inference of 3 candidate TFs critical for inducing FoxP3 and the Treg cell fate. In addition to FoxP3, induced MEFs were shown to express cluster of differentiation (CD) 4 and the hematopoietic marker CD45. Altogether, this study reports the direct reprogramming of fibroblasts to Treg cell fate and sheds light on the key players controlling Treg specification. These findings pave the way to generating a personalized immunotherapy employing induced immunosuppressive cells.

A identidade celular é adquirida através da expressão de fatores de transcrição (FTs) específicos para cada linhagem. Diversos estudos iniciados em meados do século 19 que culminaram na completa reversão de um estado somático para uma célula estaminal pluripotente induzida demonstraram que o destino celular pode ser alterado e manipulado. A reprogramação celular direta passou a ser uma estratégia alternativa para a geração de células autólogas com potencial terapêutico em medicina regenerativa. A tolerância imunitária é um processo crucial dos organismos que impede respostas imunitárias indesejadas contra o próprio ou antigénios ambientais. As células reguladoras T (Tregs) constituem parte dos mecanismos de que o organismo dispõe para promover a homeostase. As doenças autoimunes são geralmente acompanhadas de Tregs disfuncionais e os doentes podem beneficiar de terapias personalizadas baseadas nestas células. Até agora, a reprogramação celular de fibroblastos para Tregs não foi descrita. Este estudo estabelece uma estratégia para induzir um programa celular característico de Tregs em fibroblastos. Primeiro, foi feita uma análise de literatura complementada por uma análise computacional para identificar os FTs candidatos à reprogramação. Foram considerados 21 FTs por i) a sua expressão ser altamente restrita à linhagem das Tregs, ii) serem implicados no desenvolvimento e especificação desta linhagem celular e iii) terem um papel fundamental para a função imunossupressora destas células e consequente manutenção da tolerância imunitária. Os FTs candidatos foram clonados num sistema lentiviral induzível pela doxiciclina. Seguidamente, 13 FTs foram sobre expressos em fibroblastos embrionários isolados de um ratinho transgénico FoxP3-GFP. Este modelo expressa a proteína de fusão FoxP3-GFP sob controlo do promotor endógeno do FoxP3. O uso deste sistema repórter permitiu a inferência de um conjunto de 3 FTs decisivos para a ativação da expressão de Foxp3 e indução da linhagem das Tregs. Adicionalmente, em fibroblastos transduzidos com os 13 FTs, para além de expressão de FoxP3, detetou-se a expressão de CD4 e do marcador hematopoiético CD45. Concluindo, este trabalho reporta a reprogramação direta de fibroblastos em células T reguladoras, elucidando sobre novos mediadores moleculares da especificação destas células. Os resultados gerados abrem o caminho para uma futura utilização desta tecnologia para gerar imunoterapias personalizadas usando células imunossupressoras induzidas para o controlo de respostas imunes.