Insights into the mechanism of antimicrobial activity and its exploitation for developing new therapies against clinically relevant bacteria

Abstract

No último século, o uso excessivo e incorreto de antibióticos conduziu ao desenvolvimento de bactérias multirresistentes, dando origem a uma crise de resistência bacteriana a antibióticos, representando uma ameaça à saúde pública global. Assim, é crucial o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas contra infeções bacterianas. Ubíquos na natureza, os péptidos antimicrobianos (AMPs) são moléculas pequenas, anfipáticas e com carga positiva, cujo modo de ação melhor descrito se baseia na interação eletrostática entre os péptidos catiónicos e os componentes aniónicos das membranas celulares. O rompimento destas estruturas fundamentais e a interação dos AMPs com múltiplos alvos intracelulares, dificultam o desenvolvimento de mecanismos de resistência bacteriana aos AMPs. Além disso, a seletividade dos AMPs para bactérias em relação a células de mamífero acentua o seu potencial terapêutico. A morosidade e o baixo custo-benefício da síntese química e extração de fontes naturais faz com que a produção de AMPs recombinantes seja uma alternativa vantajosa. No entanto, os AMPs são suscetíveis a degradação proteolítica e podem ser tóxicos para os seus hospedeiros de expressão. Estas limitações podem ser ultrapassadas pela expressão dos AMPs fundidos com outras proteínas, nomeadamente polímeros recombinantes de base proteica (rPBP), que atuam como tags de produção e purificação, protegendo os AMPs de potencial proteólise. Adicionalmente, esta estratégia permite o desenvolvimento de biopolímeros com atividade antimicrobiana e seu processamento em diferentes materiais antimicrobianos. Dado o equilíbrio único entre suas propriedades mecânicas, de biocompatibilidade e de biodegradabilidade, polímeros recombinantes semelhantes à elastina (ELRs) e as proteínas com base na seda e na elastina (SELPs) são duas das famílias mais extraordinárias de rPBPs para aplicações biotecnológicas. Nesta tese é descrita a funcionalização de um SELP e um ELR com diferentes AMPs, a sua produção biológica em Escherichia coli e o processamento dos polímeros híbridos em diferentes estruturas. Estes polímeros mostraram atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Além disso, foi explorado o uso do ELR como parceiro de fusão para a produção e isolamento de AMPs bioativos. O trabalho desenvolvido contribui para o desenvolvimento de biomateriais avançados adequados para aplicações biomédicas e para o desenvolvimento de uma plataforma biotecnológica para a produção e purificação de AMPs.

Over the last century, the overuse and misuse of antibiotics has led to the development of bacteria resistant to these antimicrobial agents, prompting an antimicrobial resistance (AMR) crisis that continues to emerge as a global public health threat. For this reason, it is of foremost importance to develop new therapeutic approaches against bacterial infections. Ubiquitous in nature, antimicrobial peptides (AMPs) are small, amphipathic and positively charged molecules, with the best described mode of action based on the electrostatic interaction between the cationic peptides and the negatively charged components on bacterial cell membranes. The disruption of these fundamental structures and their interaction with multiple targets within the cell turns unlikely the development of bacterial resistance mechanisms against AMPs. In addition, selectivity of AMPs towards bacteria over mammalian cells further increases their therapeutic potential. Chemical synthesis of AMPs or extraction from natural sources are often time-consuming and low cost-effective procedures. The heterologous production of AMPs represents an advantageous alternative, allowing the implementation of scalable and efficient processes. Albeit the benefits of recombinant production, AMPs are susceptible to proteolysis and can be toxic for their production hosts. Nevertheless, these limitations can be overcome through the expression of AMPs fused with other proteins, namely protein-based recombinant polymers (rPBP), that act as production and purification tags while protecting AMPs from proteolytic degradation. In addition, this strategy also allows the development of biopolymers with antimicrobial activity and their processing into different antimicrobial materials. Owing to the unique balance between their mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, elastin-like recombinamers (ELRs) and silk-elastin-like proteins (SELPs) are two of the most remarkable families of rPBPs for biotechnological applications. In this thesis, we report the functionalization of a SELP and an ELR with different AMPs, their biological production using Escherichia coli as the expression system and the processing of the hybrid polymers into different types of structures. These polymers showed antimicrobial activity against both Gram-positive and Gram-negative bacteria. In addition, we explored the use the ELR as fusion partner for the production and isolation of bioactive AMPs. The work developed provides the basis for the development of advanced biomaterials suitable for biomedical applications and the development of a biotechnological platform for the production and purification of AMPs.