Marine inspired composite biomaterials envisaging the engineering of hard tissues

Abstract

The growing life expectancy pays the price of ageing-related musculoskeletal system diseases, compelling the urgent need for development of novel therapeutic strategies. Collagen-based solutions have been widely employed, but the primary sources for obtaining collagen, bovine and porcine, are not enough to keep up with needs. On the one hand, they conflict with certain religious beliefs, while on the other hand restrictive rules have been limiting their use, namely concerning the problems associated with the non-negligible risk of diseases transmission to humans, like bovine spongiform encephalopathy (BSE). Furthermore, we are facing the problem of terrestrial animals’ overexploitation, that even so, does not meet the crescent collagen demands (Chapter I). With this background, the work developed under the scope of this thesis focuses on the use of marine biomass, particularly blue shark (Prionace glauca) skin, as a promising source of collagen for production of safe, eco-sustainable and versatile composite biomaterials envisaging the engineering of hard tissues. The potential of blue shark collagen was tested after processing it in combination with marine-origin bioapatite, by freeze-dry technique, rendering 3D composite scaffolds. These 3D microporous scaffolds were suitable for Saos-2 cell line culture (Chapter III) and revealed capacity to promote in vivo bone regeneration in critical-size bone defects created in New Zealand rabbit models, 12 weeks post-implantation, similar to the performance observed with bovine collagen-based composite scaffolds (Chapter IV). Freeze-dry was also employed to produce blue shark collagen and blue shark collagen:hyaluronic acid scaffolds, with the former being able to trigger early-stage chondrogenic differentiation of human adipose stem cells (hASC), with hyaluronic acid being needed to support later stage chondrocyte phenotype (Chapter V). Inspired on the composite nano structural organization of mineralized tissues, a co-precipitation approach was followed to in situ mineralize blue shark collagen to ultimately produce stable bioinks to enable bioprinting approaches (Chapter VI and VII). Mouse fibroblast cell line (encapsulated) survival during and after printing was favored by the presence of mineralized collagen as exhibited by the biological performance of the hydrogels (Chapter VI). The osteogenic potential of the ink on encapsulated hASC, without exogeneous stimulations, was confirmed by immunodetection of RUNX2 and Osteopontin 21 days after hydrogels culture (Chapter VII). Based on a strategy of blue shark by-products valorization, highly promising tissue engineering approaches were developed envisioning the regeneration of bone and cartilage.

O aumento da esperança média de vida e, consequentemente, das doenças do sistema músculoesquelético relacionadas com o envelhecimento, forçam a necessidade do desenvolvimento urgente de novas estratégias terapêuticas. Soluções baseadas em colagénio têm sido amplamente aplicadas; no entanto, as principais fontes de obtenção de colagénio, bovinas e porcinas, não são suficientes para suprir as necessidades. Por um lado, estas soluções entram em conflito com certas crenças religiosas, por outro lado, o seu uso tem sido limitado pelo risco de transmissão de doenças a humanos, como a encefalopatia bovina espongiforme. Para além disso, enfrentamos o problema da sobre-exploração de animais terrestes, que ainda assim não seria suficiente para acompanhar a crescente procura por colagénio (Capítulo I). Nesta perspetiva, o trabalho desenvolvido no âmbito desta tese foca-se no uso de subprodutos marinhos, particularmente pele de tubarão azul (Prionace glauca), como uma fonte promissora de colagénio para a produção de biomateriais compósitos, ambientalmente sustentáveis e versáteis para a aplicação na engenharia de tecidos duros. O potencial do colagénio foi testado, após processamento, em estruturas 3D preparadas pela técnica de liofilização. As estruturas mostraram-se adequadas para cultura com a linha celular Saos-2 (Capítulo III). In vivo, o potencial destas estruturas foi avaliado, 12 semanas após implantação em defeitos ósseos críticos criados em coelhos. Os resultados não mostraram diferenças significativas em comparação com estruturas de colagénio de origem bovina (Capítulo IV). No Capítulo V, a técnica de liofilização foi aplicada para produzir estruturas de colagénio e estruturas de colagénio:ácido hialurónico para estudar o potencial condrogénico de células estaminais do tecido adiposo humano, com e sem estimulação exógena. As estruturas de colagénio desencadearam a condrogénese no seu estágio inicial, enquanto o ácido hialurónico suportou o fenótipo de condrócitos num estágio posterior. Atendendo à nano-organização estrutural de tecidos mineralizados, foi explorada, nos Capítulos VI e VII, a mineralização in situ do colagénio para preparação de pastas para impressão. Fibroblastos incorporados na pasta revelaram uma maior sobrevivência, durante e após impressão, com o aumento da quantidade de colagénio. O potencial osteogénico da pasta, sem qualquer estímulo exógeno, foi confirmado através da imunodeteção da RUNX2 e Osteopontina 21 após cultura de células estaminais do tecido adiposo dos hidrogéis. A valorização de subprodutos de tubarão resultou em abordagens terapêuticas altamente promissoras para aplicação em Engenharia de Tecido.

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