Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature lung epithelium in-vitro

Abstract

As doenças de foro respiratório são altamente prevalentes a nível mundial, encontrando-se no grupo das doenças mais fatais em países desenvolvidos. Epitélio pulmonar gerado in-vitro a partir de células estaminais pluripotentes humanas tem aplicações em medicina regenerativa, no estabelecimento de novos modelos de doença, ensaios farmacológicos pré-clínicos e estudo do desenvolvimento humano. Neste trabalho descrevemos uma estratégia para gerar células da via aérea e alveolares maturas a partir de células estaminais pluripotentes humanas. Seguimos os paradigmas do desenvolvimento para gerar progenitores pulmonares (PPs) a partir das células estaminais e descobrimos que a glycogen synthase kinase 3 (GSK3) desempenha um papel central no balanço entre expansão de progenitores e a sua maturação em multi-linhagem. É importante realçar que a maioria das células geradas através do nosso método exibia características similares a células pulmonares pós-natais. Para além disso, o nosso modelo permitiu inferir um novo mecanismo envolvido no desenvolvimento pulmonar humano. Demonstramos que o efeito da inibição da maturação pela GSK3 no seu estado inibido é em parte devido à regulação do ciclo celular. Em culturas libertadas da inibição da GSK3, a via de sinalização NOTCH favorece a maturação dos PPs em populações epiteliais distais, inibindo as mais proximais, enquanto que a via WNT promove a maturação de células de Clara, implicando desta forma ambas as vias de sinalização no processo de especificação proximo-distal do epitélio pulmonar. Finalmente, demonstramos que o modelo desenvolvido é passível de ser utilizado com plataforma para desenvolvimento de modelos de doença respiratória humana e que poderá ser uma ferramenta importante para estudos sobre a fisiologia e importância de populações epiteliais pulmonares raras.

Respiratory diseases are highly prevalent worldwide and consistently rank within the group of the most fatal diseases in developed countries. Lung epithelium generated in-vitro from human pluripotent stem cells (hPSCs) has tremendous potential for applications in regenerative medicine, disease modeling, pre-clinical drug screenings and the study of human development. Here we describe a strategy to derive mature airway and alveolar lung epithelium from hPSCs. We followed developmental cues to derive hPSCs towards lung progenitors (LPs) and found that glycogen synthase kinase 3 (GSK3) plays a central role in the balance between progenitor expansion and multilineage maturation of LPs. Importantly, the majority of the cells generated by our method exhibited characteristics similar to those found in postnatal human lungs. Our model offers novel mechanistic insight into human lung development. We show that the maturation inhibiting effects of GSK3 inhibition (GSK3i) in our cultures is partly due to cell cycle regulation. In addition, upon release of GSK3i, NOTCH signaling induces a distal cell fate at the expense of proximal and ciliated cell fates, whereas WNT signaling promotes a proximal club cell fate, implicating both signaling pathways in proximodistal specification of the human lung. Finally, we demonstrate that the model we developed is suitable for modelling of human respiratory diseases and could be a valuable tool to study the physiology and relevance of rare lung epithelium populations.