Water biofilm modulation by fungi

Abstract

Water is indispensable to life and a safe and accessible supply must be available to all. The presence of microorganisms is a threat to this commitment. Biofilms are the main reservoir of microorganisms inside water distribution systems and they are extremely ecologically diverse. Biofilm formation in drinking water has mainly been studied regarding bacteria, however, filamentous fungi and bacteria can coexist inside these systems forming inter-kingdom biofilms. The ecology of a biofilm is a complex function of different factors, including the presence of microbial metabolites excreted by its inhabitants. The present work aimed to study the ability of filamentous fungi to interact and influence bacteria whilst forming inter-kingdom biofilms. For this purpose, different methods to analyse biofilms were applied, including total biomass, metabolic activity, bacterial colony forming units and epifluorescence microscopy. The study on the effect of quorum sensing molecules and fungal secondary metabolites on inter-kingdom biofilm formation and development was also done. In addition, an RT-qPCR method to quantify a gene involved in the patulin biosynthetic pathway was performed and the expression levels were compared with the patulin production in inter-kingdom biofilms. The results revealed fungal stage development is important in the first 24 h of biofilm formation. Inter-kingdom biofilm formation is microorganism dependent and inter-kingdom biofilms may provide an advantage to the opportunistic bacterium Acinetobacter calcoaceticus to replicate and proliferate. Methylobacterium oryzae biofilm formation and development was more susceptible to the presence of exogenous molecules than A. calcoaceticus biofilms. The effect of M. oryzae on Penicillium expansum biofilms is dependent on the time of interaction. More mature P. expansum biofilms appear to be more resistant to the inhibitory effect that M. oryzae causes towards idh gene expression and patulin production. M. oryzae affects patulin production by acting at the transcriptional level of the idh gene. In conclusion, a possible protection role of filamentous fungi towards opportunistic bacteria inside complex biofilms is reported. Moreover, quorum sensing and quenching molecules play a vital role in inter-kingdom communication and/or microbial assembly processes that influence biofilm formation between filamentous fungi and bacteria.

A água é indispensável à vida e um fornecimento seguro deve estar disponível para todos. A presença de microrganismos é uma ameaça a este compromisso. Os biofilmes são a principal fonte de microrganismos em sistemas de distribuição de água e são ecologicamente muito ricos. A formação de biofilmes em sistemas de água de consumo tem sido estudada principalmente em relação às bactérias, contudo, nestes sistemas, fungos filamentosos e bactérias interagem formando biofilmes mistos. A ecologia de um biofilme é extremamente complexa e é suscetível a diferentes fatores como a presença de metabolitos microbianos excretados pelos seus habitantes. O trabalho aqui apresentado teve como objetivo o estudo da capacidade de fungos filamentosos interagirem e influenciarem bactérias enquanto formam biofilmes mistos. Com este propósito, diferentes métodos de análise de biofilmes foram usados, incluindo biomassa total, atividade metabólica, unidades formadoras de colónias bacterianas, e microscopia de epifluorescência. Foi também realizado o estudo do efeito de moléculas de quórum sensing e metabolitos secundários produzidos por fungos na formação e desenvolvimento de biofilmes mistos. Adicionalmente, foi usado um método de RT-qPCR para quantificar um gene relacionado com a via biossintética da patulina e os valores de expressão relativa foram comparados com a produção de patulina em biofilmes mistos. Os resultados revelaram que o estado de desenvolvimento do fungo filamentoso aquando da inoculação é importante nas primeiras 24 h de formação de biofilme. A formação de biofilmes mistos é dependente dos microrganismos presentes e pode conferir uma vantagem a bactérias oportunistas como a Acinetobacter calcoaceticus para se replicar e proliferar. A formação e desenvolvimento de biofilmes da Methylobacterium oryzae demonstrou ser mais suscetível à presença de moléculas exógenas do que os biofilmes da A. calcoaceticus. O efeito da M. oryzae em biofilmes do Penicillium expansum é dependente do momento de interação. Biofilmes fúngicos mais maduros parecem ser mais resistentes ao efeito inibitório que a M. oryzae causa na expressão do gene idh e na produção de patulina. Esta bactéria afeta a produção de patulina atuando ao nível transcricional do gene idh. Em conclusão, é aqui reportado um possível efeito protetor que o fungo filamentoso confere a bactérias oportunistas em biofilmes mistos. Além disso, a presença de moléculas de quórum sensing e de metabolitos secundários desempenham um papel fundamental por parte dos diferentes microrganismos em biofilmes mistos, que resultam na regulação de processos que levam à sua formação e estabelecimento.