Deciphering the microbiome and metabolic factors contributing to protection against ulcerative colitis

Abstract

Inflammatory bowel disease (IBD) is a complex set of inflammatory disorders from the gastrointestinal tract, comprising Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC). Although the precise etiology of this disease remains unclear, the pathogenesis of IBD has been defined as an immune-mediated condition with a strong genetic predisposition, triggered by environmental factors that affect the mucosal barrier and the balance of the gut microbiota. In this work, we aimed to identify relevant microbiota species that may influence the susceptibility or protection against colitis development and how the modulation of dietary nutrients impacts the outcome of disease. While analyzing dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in genetically similar C57BL/6 mice housed in two different animal facilities, we serendipitously observed a group of animals with a remarkable protection to disease development. The two groups of mice display distinct microbiota and metabolic profiles, clustering separately in multivariate data analysis. This can be at the genesis of the resistant phenotype, since fecal microbiota transplant (FMT) from resistant to susceptible mice was able to reverse colitis susceptibility. We identified Akkermansia muciniphila and Parabacteroides distasonis as metagenomic top hits, being enriched in resistant mice, and in susceptible mice after receiving FMT from the resistant group. Resistant mice also evidenced significantly increased levels of IL-10, IL-17 and IL-22, as well as increased expression of claudin- and mucin-encoding genes in homeostatic conditions when compared to the susceptible group, suggesting that the protective phenotype is associated with an intestinal epithelial barrier more prone to sustaining an inflammatory insult. Indeed, by analyzing the effect of these bacterial candidates on colonic epithelial cells using a biochip-based human gut model, an increased expression of E-cadherin was found when cells were incubated with A. muciniphila, recapitulating the findings observed in vivo. We are currently dissecting in the gut-on-a-chip model how these candidates modulate epithelial barrier integrity to increase protection against an inflammatory event, to further validate these results in an in vivo susceptible model of colitis. In parallel, we were focused in evaluating how dietary supplementation can contribute to the protection against the development of IBD or, at least, for a better resolution of the disease. It is known that the metabolic environment in the gut is altered during pathology. Therefore, we analyzed the colon metabolic profile of mice during colitis development, in order to identify possible altered nutrients that might be used as promising prophylactic or therapeutic approaches. We observed that mice treated with DSS display a twofold decrease in threonine levels in the intestine. Knowing this, threonine supplementation was evaluated as possible therapy by treating mice on the beginning of colitis development or when the inflammation was already established. We observed that threonine has a detrimental effect when administered during colitis onset, with mice evidencing a delayed remission of the disease when compared to control group or mice treated with threonine only during inflammation. This detrimental effect is associated with a reduction in the number of goblet cells per crypt and also in decreased amounts of IL-22 in the gut. Overall, the findings presented in this thesis contribute to a better understanding of the different factors that can modulate protection and/or susceptibility to IBD development, providing novel insights to possible strategies of tackling IBD.

A doença inflamatória intestinal (DII) é um conjunto de distúrbios inflamatórios do trato gastrointestinal que engloba a doença de Crohn e a colite ulcerosa. Embora a etiologia desta doença ainda não seja clara, a patogénese da DII é uma condição mediada por respostas imunes, com uma forte predisposição genética, desencadeada por fatores ambientais que afetam a barreira da mucosa e o equilíbrio do microbiota intestinal. Este trabalho tem como objetivos a identificação de espécies do microbiota que possam influenciar a suscetibilidade ou proteção contra o desenvolvimento de colite e de que forma é que a modulação de nutrientes presentes na dieta afeta o decurso da doença. Ao analisar o perfil de colite induzida por dextrano sulfato de sódio (DSS) em murganhos C57BL/6 geneticamente semelhantes e alojados em diferentes biotérios, observamos por acaso que um dos grupos de animais apresentava uma elevada proteção contra o desenvolvimento da doença. Os dois grupos de murganhos apresentam perfis metabólicos de microbiota distintos, agrupando-se isoladamente na análise de dados multivariada. Estes perfis podem estar na base do fenótipo de proteção, visto que o transplante de microbiota fecal (FMT) de animais resistentes para suscetíveis foi capaz de reverter a suscetibilidade à colite. Através de uma análise de metagenómica, identificamos que as espécies Akkermansia muciniphila e Parabacteroides distasonis encontram-se significativamente enriquecidas em murganhos resistentes ou em animais suscetíveis após FMT proveniente de murganhos resistentes. Estes animais também apresentaram níveis significativamente elevados de IL-10, IL-17 e IL-22, bem como um aumento na expressão de genes que codificam as proteínas claudinas e mucinas, em condições de homeostasia quando comparados ao grupo suscetível, o que sugere que o fenótipo protetor está associado à existência de uma barreira epitelial intestinal mais propensa a tolerar um insulto inflamatório. Aliás, através da análise das bactérias candidatas em células epiteliais do cólon usando um modelo de intestino humano em formato biochip, foi detetada uma maior expressão de E-caderina nas células incubadas com A. muciniphila, recapitulando as observações feitas in vivo. Neste momento estamos a explorar no modelo “gut-on-a-chip” de que forma esses candidatos modulam a integridade da barreira epitelial para aumentar a proteção contra um evento inflamatório, para validar posteriormente esses resultados num modelo in vivo de suscetibilidade à colite. Em paralelo avaliamos de que forma a suplementação na dieta contribui para a proteção contra o desenvolvimento de DII ou, pelo menos, para uma melhor resolução da doença. O ambiente metabólico no intestino é alterado durante a patologia. Como tal, analisamos o perfil metabólico do cólon de murganhos durante o desenvolvimento de colite, com vista a identificar possíveis nutrientes alterados que possam ser utilizados em estratégias de profilaxia ou terapia. Murganhos tratados com DSS exibiram uma diminuição de duas vezes nos níveis de treonina no intestino. Como tal, a suplementação com treonina foi avaliada como possível terapia, sendo administrado este nutriente a murganhos no início do desenvolvimento de colite ou quando a inflamação já estava estabelecida. Descobrimos que a treonina tem um efeito prejudicial quando administrada durante o início da colite, com os animais a evidenciar uma recuperação mais lenta da doença quando comparados com o grupo controlo ou com murganhos que receberam treonina apenas durante a inflamação. Simultaneamente a este efeito prejudicial, encontrou-se uma redução no número de células caliciformes por cripta intestinal e níveis mais baixos de IL- 22 no intestino. Em conclusão, os resultados apresentados nesta tese contribuem para uma melhor compreensão dos diferentes fatores que podem modular a proteção e/ou suscetibilidade ao desenvolvimento de DII, dando novas perspetivas sobre as possíveis estratégias para combater esta doença.