SIRT1 and energy metabolism in rodent Sertoli cells

Abstract

In the last years, sirtuins have been identified as active participants in metabolic coordination of various organs and cells, being involved in the modulation of multiple metabolic pathways. Among all deacetylases, sirtuin 1 (SIRT1) has been the most studied. Still, little is known about its role in regulating testicular metabolism. We hypothesized that SIRT1 might have a regulatory action in Sertoli cells and consequently in spermatogenesis. The aim of this project was to study the role of SIRT1 in mouse Sertoli cells (mSCs). For that purpose, we exposed cells to increasing concentrations of an inhibitor (EX-527) or an activator of SIRT1 (YK-3-237) and we evaluated their cytotoxicity and the metabolic profile of TM4 cell line. The cytotoxic profile was studied by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), lactate dehydrogenase (LDH) release and sulfhorodamine B (SRB) assays. We evaluated mitochondrial function by determining the mitochondrial complexes expression levels and mitochondrial potential (JC-1 assay). The metabolic profile of mSCs was determined by Nuclear Magnetic Resonance (1H-NMR) technique, and by the quantification of intracellular glycogen content and lipid accumulation. The oxidative damages in cells was also analyzed (specially lipid peroxidation) and the apoptotic profile was also assessed by determining caspase-3 activity and the expression of anti and pro- apoptotic proteins. The exposure of either SIRT1 activator or inhibitor at the selected doses presented no toxicity to mSCs. However, increased caspase-3 activity was observed when cells were exposed to EX-527 (100 nM), suggesting an activation of apoptotic pathway. On the other hand, SIRT1 activator (10000 nM) modulated mitochondrial function, favoring the functioning of the oxidative phosphorylation, and under these conditions, mSCs exhibited higher levels of lipid peroxidation. Metabolically, when SIRT1 is activated (YK-3-237, 10000 nM) there is an increase in glucose and pyruvate consumption, demonstrating that there is an enhancement in glycolytic flow, which translated into an increase in lactate production (essential for spermatogenesis). Additionally, there was a decrease in lipid accumulation, suggesting its metabolization in mitochondria. In sum, modulation of SIRT1 activity in mSCs leads to changes in metabolic profile. Particularly, the activation of SIRT1 with YK-3-237 modulates the metabolic performance, without affecting cell viability and proliferation and thus, SIRT1 can be considered as control point of testicular metabolism.

Nos últimos anos, as sirtuinas têm sido apontadas como participantes ativos na coordenação metabólica em diversos órgãos e células, estando envolvidas na modulação de diversas vias metabólicas. De entre as desacetilases, a sirtuina 1 (SIRT1) tem sido das mais estudadas. Ainda assim, pouco se sabe acerca do seu papel na regulação do metabolismo testicular. A premissa deste trabalho é que a SIRT1 tem uma ação reguladora no metabolismo das células de Sertoli e consequentemente na espermatogénese. O objetivo deste trabalho foi estudar o papel da SIRT1 em células de Sertoli de ratinho (mSCs). Para isso expusemos as células a concentrações crescentes de um inibidor (EX-527) ou um ativador (YK-3-237) da SIRT1 e avaliámos a sua citotoxicidade e o seu impacto no perfil metabólico de uma linha de células de Sertoli de ratinho (TM4). O perfil citotóxico dos compostos foi estudado utilizando os ensaios de Brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT), libertação de lactato desidrogenase (LDH) e ensaio de sulforodamina B (SRB). Avaliámos a função mitocondrial, determinando os níveis de expressão dos complexos mitocondriais e o potencial mitocondrial (ensaio JC-1). O perfil metabólico das mSCs foi determinado por Ressonância Magnética Nuclear (1H-NMR) e pela quantificação do glicogénio armazenado e reservas lipídicas. Foram também analisados os danos oxidativos (especificamente a peroxidação lipídica) e o perfil apoptótico, determinando a atividade da caspase-3 e a expressão de proteínas anti e pró-apoptóticas. A exposição das mSCs ao ativador ou inibidor da SIRT1 nas doses selecionadas não apresentou qualquer toxicidade para as células. No entanto, observou-se um aumento da atividade de caspase-3 quando as células foram expostas ao EX-527 (100 nM), sugerindo uma ativação da via apoptótica. Por outro lado, o ativador da SIRT1 (10000 nM) modulou a função mitocondrial, favorecendo a fosforilação oxidativa, sendo que as células nessas condições exibiram níveis mais elevados de peroxidação lipídica. Metabolicamente, quando a SIRT1 está ativada (YK-3-237, 10000 nM), há um aumento do consumo de glucose e piruvato, evidenciando um favorecimento do fluxo glicolítico, que se traduziu num aumento da produção de lactato (essencial para a espermatogénese). Adicionalmente, houve uma diminuição da acumulação lipídica, sugerindo a sua metabolização na mitocôndria. Em suma, a modulação da atividade da SIRT1 em mSCs leva a alterações do perfil metabólico dessas células. Em particular, a ativação da SIRT1 com YK-3-237 modula o desempenho metabólico das mSCs, favorecendo o metabolismo mitocondrial, sem afetar a viabilidade e proliferação celular, portanto, pode ser considerado como um ponto de controlo do metabolismo testicular.