Evaluation of the potential of yeast strains as antagonists of fungal phytopathogens

Abstract

The Mediterranean region is intrinsically connected to olives and olive oil production. In the last few years, olive tree orchards have been severely threatened by the fungal disease Olive Anthracnose (OA). This is caused by various Ascomycete fungi from the Colletotrichum genus, clustering in the C. gloeosporioides and C. acutatum species complexes. OA critically affects crop production, pre- and post-harvest, as well as oil quality, often causing total yield losses. OA has thus a very high negative socioeconomic impact in the region. Currently, disease management is mainly achieved by using chemical fungicides, sometimes coupled with agricultural strategies like pruning or early harvesting. These approaches are not effective and, in the case of chemical fungicides, pose a significant threat to the environment and human health, from which it is imperative to find new efficient and eco-friendly alternatives. One such option could be in field biological control, using specific biocidal agents unharmful for the environment. Yeasts are among the microorganisms with known specific antagonistic activity against other yeasts, bacteria or filamentous fungi. This occurs through several mechanisms including the competition for space and nutrients, and the secretion of chemicals or peptides toxic for the antagonised species. The present work aims to evaluate the potential of yeasts as antagonists of OA’s causal agents. It focuses on yeast strains originating from industrial fermentation processes, as well as the olive biome. A total of twenty-one yeasts were tested against C. gloeosporioides, C. godetiae and C. nymphaeae, originating from infected olive orchards in Italy and Portugal, including the Northern region of the latter. Antagonism was assessed in co-culture assays, in solid and in liquid media. The death of fungi was microscopically confirmed by staining the mycelium with Methylene Blue and Propidium Iodide. Results showed the inhibition of growth of the three fungal strains by several yeast strains from both olive biome and industrial fermentations. Such inhibition was not always coupled with cell death, suggesting different modes of action. The most promising strains are two Wickerhamomyces anomalus, one from each environment, that inhibited the growth of all Colletotrichum sp.. The strain obtained from the olive microbiome showed the highest inhibition and caused the most death. Based on these promising results, further work is underway to develop a protocol for in field application of these yeasts as biocides in the management of OA in Portugal.

A Oliveira é uma cultura intrinsecamente ligada à região do Mediterrâneo. Nos últimos anos, os olivais têm sido fortemente ameaçados com uma fitopatologia, a Antracnose da Oliveira (AO). Esta é causada por um consórcio de fungos filamentosos, agrupados nos complexos C. acutatum s.l. and C. gloeosporioides s.l.. A antracnose da oliveira afeta gravemente a produção de azeitona, antes e depois da sua colheita, e a qualidade do azeite produzido, causando prejuízos muitas vezes totais. Atualmente o controlo da doença é feito maioritariamente com recurso a fungicidas químicos, por vezes acompanhado por práticas agrícolas, tais como podas seletivas ou colheitas precoces. Estas abordagens de gestão não são eficazes e, no caso dos fungicidas químicos, representam uma ameaça significativa para o ambiente e para a saúde humana. Tendo isto em conta, é imperativo encontrar novas técnicas eficientes e ecológicas para controlar a AO. Uma opção poderia ser o controlo biológico, usando agentes biocidas específicos e que não constituíssem perigo para a saúde humana e não prejudicassem o meio ambiente. As leveduras estão entre os microrganismos com atividade antagonista contra outras leveduras, bactérias e fungos filamentosos. Existem vários mecanismos pelos quais as leveduras são capazes de antagonizar outros organismos, incluindo a competição por espaço e nutrientes, e a secreção de compostos ou péptidos antimicrobianos. O presente trabalho visa avaliar o potencial de leveduras como antagonistas dos agentes causais da AO. Para tal foram usadas estirpes de leveduras originárias da indústria da fermentação do bioetanol e da cachaça, bem como do microbioma da oliveira. Um total de vinte e uma estirpes de levedura foram testadas contra C. gloeosporioides, C. godetiae e C. nymphaeae, provenientes de olivais infetados em Itália e Portugal, incluindo a Região Norte. A atividade antagónica das leveduras foi avaliada, em ensaios de co-cultura em meio sólido e líquido. A morte celular foi confirmada por microscopia, por coloração com Azul de Metileno e iodeto de propídio. Os resultados revelam a inibição do crescimento dos três fungos por várias estirpes de levedura provenientes do bioma da oliveira e das fermentações industriais. Verificou-se que a inibição do crescimento nem sempre estava associada à morte celular, sugerindo diferentes modos de ação. As estirpes de levedura mais promissoras são duas Wickerhamomyces anomalus, capazes de inibir o crescimento de todas a estirpes de Colletotrichum sp., cada uma proveniente de um dos dois tipos de ambiente. Em particular a do bioma da oliveira apresentou a maior percentagem de inibição e causou a maior morte celular. Com base nestes resultados promissores, está em curso um trabalho para desenvolver um protocolo para a aplicação em campo destas leveduras como biocidas na gestão da OA em Portugal.