Bionanostructures for intracellular temperature sensing during hyperthermia cancer treatments

Abstract

Cancer is a disease characterized by abnormal fast growth of cells. The current treatments used, chemo and radiotherapy, besides not being 100 % effective, have also serious side-effects. One of the most promising treatments under study are the hyperthermia ones, where a temperature increase is locally applied. One of such thermal treatments is magnetic hyperthermia, which is performed by local administration of magnetic nanoparticles and their exposure to an alternating magnetic field. This work aims at providing a method to assess the intracellular temperatures achieved during magnetic hyperthermia treatments. The green fluorescence protein (GFP), that is compatible with live cells was used as a luminescent nanothermometer and can report temperature changes from various locations within the cell. Three different GFP variants were analyzed: i) nontagged-GFP was used to test temperature evolution in the cytoplasm, ii) Actin-GFP to test temperature along cytoskeleton proteins and iii) Mito GFP to test the local temperature at the mitochondria. To assure nanothermal sensing during efficient magnetic hyperthermia treatment in in vitro live cell models, first the uptake of magnetic nanoparticles, their intracellular localization and toxicity were analyzed. Inductively couple plasma - optical emission spectroscopy (ICP-OES) results show that Fe3O4 nanoparticles are taken up in a concentration and time-dependent manner. A concentration dependent toxicity is observed at incubation times of 24h, with cell viability decreasing to values lower than 80 %, at concentrations higher than 50 μg/mL. Transmission electron microscopy (TEM) images reveal that such nanoparticles localize mainly in aggregates in vicinities of the nucleus membrane. Temperature dependent studies showed a linear decrease of the GFP fluorescence lifetime with increasing temperature, while no correlation was observable with fluorescence polarization anisotropy when in actin-GFP proteins and in nontagged-GFP. Intracellular temperatures achieved during magnetic hyperthermia treatment using exposure times as reported for clinical tests, approximately 30 min, reach up to 75 ºC degrees, which is considerably higher than required for the induction of local cell death. In summary, a novel intracellular temperature measurement technique based on the fluorescence lifetime measurement of GFP was developed and validated within a range of magnetic nanoparticle concentration that is not considered toxic.

O cancro é uma doença caracterizada por uma divisão celular anormalmente rápida. Os tratamentos convencionais usados (ex: quimio e radioterapia), além de não serem 100 % eficazes, possuem também sérios efeitos secundários. Atualmente os tratamentos hipertérmicos, são muito promissores, onde temperaturas acima do ideal são localmente aplicadas. A hipertermia magnética é um tipo de tratamento hipertérmico que consiste na administração local de nanopartículas magnéticas que são expostas a um campo magnético alternado. Este trabalho teve como objetivo providenciar um método para detetar as temperaturas intracelulares atingidas durante este tipo de tratamento. A proteína verde fluorescente (GFP) foi testada como um nanotermómetro luminescente, para reportar diferenças de temperatura em vários locais intracelulares, uma vez que é compatível com células vivas. Foram analisadas três variantes de GFP: i) GFP não marcada para testar a evolução da temperatura no citoplasma, ii) actina-GFP para testar a temperatura no citoesqueleto, iii) mito-GFP para testar a temperatura na mitocôndria. Para assegurar uma deteção eficiente das temperaturas atingidas durante a hipertermia magnética em modelos in vitro, foi analisado a internalização, localização intracelular e toxicidade das nanopartículas magnéticas. Os resultados de espectrometria de Emissão Ótica por Plasma Acoplado Indutivamente (ICP-ES) mostraram que nanopartículas de Fe3O4 foram internalizadas numa forma dependente do tempo e da concentração. Foi também observado que para tempos de incubação de 24 h, a toxicidade era dependente da concentração, apresentando uma viabilidade celular menor que 80 % para concentrações superiores a 50 μg/mL. Imagens de microscopia eletrónica de transmissão revelaram que estas nanopartículas se encontravam localizadas maioritariamente em agregados nas vizinhanças do núcleo. Estudos dependentes da temperatura mostraram que havia uma diminuição linear dos tempos de vida de fluorescência com o aumento da temperatura, enquanto que não foi observada qualquer correlação na anisotropia de fluorescência polarizada quando se utilizaram células não marcadas ou marcadas com actina. Durante o tratamento de hipertermia magnética, usando tempos de exposição comparados como os reportados em ensaios clínicos, foram atingidas temperaturas intracelulares de 75 ºC, consideravelmente mais elevadas do que as temperaturas requeridas para induzir morte celular localizada. Em resumo, foi desenvolvida e validada uma nova técnica de medição de temperatura intracelular baseada nas medidas de tempos de vida de fluorescência numa gama de concentrações consideradas não tóxicas.