New aspects in coordination of vertebrate limb bud development

Abstract

Limb development requires precise orchestration of cell proliferation and differentiation in both time and space. Chick limb skeletal elements are laid down as cartilaginous primordia with the same initial size and grow differentially in a proximaldistal (P-D) sequence giving rise to seven skeletal compartments. Two models seek to explain cell fate specification along the P-D limb axis. Although fundamentally different, both models imply the existence of a limb bud distal zone where cells reside until they reach the time to differentiate - progress zone model -, or to expand - early specification model. However, how these cells measure time remains unknown. In 1997, the identification of the somitogenesis molecular clock brought new insight into how embryonic cells measure time. Another interesting discovery made in the somitogenesis system is the observation of a maturation wavefront. When this maturation wavefront is experimentally shifted anteriorly by placing an Fibroblast Growth Factor (FGF)8-coated bead in the mid-presomitic mesoderm (PSM), smaller somites are formed. In the work developed during the course of this PhD thesis, we analysed the expression of the somitogenesis molecular clock components hairy1 and hairy2 during chick forelimb development. We provide the first evidence for a molecular clock operating during limb outgrowth and patterning by showing that the expression of the somitogenesis clock component hairy2 cycles in limb chondrogenic precursor cells with a 6 hour periodicity. We determined the time period required to form an autopod skeletal limb element and propose that the forelimb second phalanx takes 12 hours to be formed, suggesting that an autopod limb skeletal element is formed by cells with “n” and “n+1” hairy2 expression cycles. In analogy to the somitogenesis maturation wavefront, we also hypothesise the existence of a wavefront that could be travelling in limb bud distal mesenchyme. Since FGF8 protein and fgf8 mRNA expressed in the Apical Ectodermal Ridge (AER) is activating MAPK phosphatase 3 (mkp3) expression in the distal limb mesenchyme, we have characterized the expression pattern of this gene and found that mkp3 presents a graded distribution of its transcripts in distal limb bud mesenchyme. We also analysed the expression pattern of intronic mkp3 probe and propose that mkp3 in limb distal mesenchyme acts in a similar way to fgf8 in the PSM. Furthermore, similarly to what occurs during somitogenesis, shorter limb elements are obtained when mkp3 expression under influence of FGF8 is extended proximally. We also demonstrate that AER-derived FGF8 signalling positively regulates hairy2 expression in the distal limb mesenchyme. The work performed in this thesis proposes that somitogenesis and limb bud are two parallel systems. Both have a zone where cells are maintained in an undifferentiated state (PSM and distal limb mesenchyme). In both these zones a molecular clock is operating regulating the periodicity of structure formation. We also suggest that these zones are maintained undifferentiated by the FGF/ Wingless int (WNT) signalling pathways that control the size of the elements formed. Recently, Mitogen Activated Protein Kinase/ Extracellular signal-Regulated Kinase (MAPK/ERK) pathway has been implicated in this process. We moreover propose that retinoic acid (RA) and FGF have mutually inhibitory roles in limb bud development, similarly to what occurs during somitogenesis, playing a function in allocating a certain number of cells to the initiation of the chondrogenic differentiation program, resulting in the regulation of element size. Until now, all studies regarding cyclic gene expression during development have focused exclusively on somitogenesis. However, time control is absolutely required during all embryonic development and may even be considered the fourth developmental dimension. The studies performed in this thesis suggest that temporal control exerted by cyclic gene expression can be a widespread mechanism providing cellular temporal information during vertebrate embryonic development, not being an exclusive propriety of PSM cells, as previously thought.

O desenvolvimento dos membros dos vertebrados envolve uma regulação temporal e espacial estrita, quer da proliferação, quer da diferenciação celulares. As células precursoras dos elementos esqueléticos que formam o membro são dispostas sequencialmente ao longo do eixo proximal-distal (P-D). Na asa da galinha, estes elementos esqueléticos são formados com o mesmo tamanho inicial, crescendo depois diferencialmente e dando origem a sete compartimentos esqueléticos. Existem dois modelos que tentam explicar a especificação dos destinos celulares ao longo do eixo PD do membro dos vertebrados. Embora essencialmente diferentes, ambos postulam a existência de uma zona distal no membro onde as células residem até chegar o tempo de diferenciarem – modelo da zona de progresso - , ou de expandirem – modelo da especificação precoce. Contudo, continua ainda por determinar a forma como estas células adquirem a noção de tempo. Em 1997, a identificação de um relógio molecular ligado ao processo da somitogénese proporcionou novos conhecimentos na forma de como é que as células adquirem a noção de tempo. Outra descoberta interessante realizada no processo da somitogénese foi a observação de uma “wavefront” de maturação. Quando esta “wavefront” de maturação é deslocada anteriormente através da introdução de esferas embebidas em proteína Fibroblast Growth Factor (FGF)8 na região mediana da mesoderme presomítica (MPS), formam-se sómitos mais pequenos. Os estudos realizados durante o curso desta tese de doutoramento, permitiramnos mostrar pela primeira vez a existência de um relógio molecular que actua durante o desenvolvimento do membro superior do embrião de galinha. Experiências realizadas nesse sentido permitiram-nos estudar o padrão de expressão dos componentes do relógio molecular da somitogénese, hairy1 e hairy2 durante o desenvolvimento do membro superior da galinha e observar que um dos componentes do relógio, o gene hairy2 apresenta ciclos de expressão com uma periodicidade de 6 horas nas células percursoras condrogénicas do membro. Foram realizados estudos para determinar o período de tempo necessário para a formação de um elemento esquelético do membro, e propomos que cada falange é formada em 12 horas, sugerindo que um elemento esquelético do membro é formado por células com “n” e “n+1” ciclos de expressão do gene hairy2. Em analogia com a “wavefront” descrita no modelo da somitogénese, sugerimos que um processo semelhante possa estar a ocorrer no mesênquima distal do membro dos vertebrados. Devido à expressão da proteína de FGF8 e do RNAm de fgf8 na Apical Ectodermal Ridge (AER) activar a expressão de MAPK phosphatase 3 (mkp3) no mesênquima distal do membro, fomos caracterizar o padrão de expressão deste gene e observámos que existe um gradiente de expressão de mkp3 no mesênquima distal do membro. Analisamos também o padrão de expressão obtido com uma sonda intrónica de mkp3, e sugerimos que mkp3 no mesênquima distal do membro actua de uma maneira semelhante à de fgf8 na MPS. De modo idêntico ao modelo proposto para a somitogénese, demonstramos também que quando a expressão de mkp3 sob a influência de FGF8 é estendida proximalmente, os elementos esqueléticos do membro que se estão a formar nessa altura são menores. Por último, demonstramos que a sinalização de FGF8 proveniente da AER regula positivamente a expressão de hairy2 no mesênquima distal do membro. O trabalho realizado nesta tese sugere a existência de um paralelismo entre o processo da somitogénese e do membro. Ambos apresentam uma zona onde as células são mantidas num estado indiferenciado (MPS e o mesênquima distal do membro) onde está presente o relógio molecular responsável por regular a periodicidade da formação das estruturas. Em ambos os casos, estas zonas são mantidas num estado indiferenciado pelas vias de sinalização FGF/ Wingless int (WNT) que controlam o tamanho dos elementos formados. Recentemente, a via do Mitogen Activated Protein Kinase/ Extracellular signal-Regulated Kinase (MAPK/ERK) também foi implicada neste processo. Outro paralelismo interessante entre estes dois sistemas é o facto do ácido retinóico (AR) e da via de sinalização FGF inibirem-se mutuamente dando origem a que um certo número de células se distribuam para a iniciação do programa de diferenciação condrogénico, resultando na regulação do tamanho dos elementos. Até ao presente momento, todos os estudos relativos à expressão cíclica de genes ao longo do desenvolvimento embrionário, têm-se focado exclusivamente na somitogénese. Porém, o controlo temporal é absolutamente necessário durante todo o desenvolvimento embrionário, podendo mesmo ser considerado uma quarta dimensão do desenvolvimento. Os estudos realizados nesta tese de doutoramento sugerem que o controlo temporal exercido pela expressão cíclica de genes pode ser um mecanismo geral para atribuição de informação temporal celular durante o desenvolvimento embrionário dos vertebrados, e não uma propriedade exclusiva das células da MPS como acreditado até agora.