Employment of whole genome resequencing to reveal the evolutionary history and to develop molecular tools for Western European honey bees (Apis mellifera subspecies)

Abstract

The Western honey bee, Apis mellifera L., acts as a pollinator, thus playing a role in the ecosystem of paramount importance. However, the genetic integrity of many subspecies has been threatened by introgressive hybridization. In an attempt to reverse this trend, the main goals of this dissertation were (i) to reveal the genetic structure of one of the most complex and diverse subspecies in Europe, the Iberian honey bee (Apis mellifera iberiensis), and (ii) to develop molecular tools for the Iberian honey bee and its sister subspecies, the Dark honey bee (Apis mellifera mellifera), both belonging to the western European lineage M. These molecular tools can be employed for breeding and conservation programs in western and southern Europe. The Dark honey bee A. m. mellifera has been severely threatened by hybridization with subspecies of eastern European (C lineage) ancestry, such as A. m. ligustica and A. m. carnica. Using 113 haploid honey bees collected from eight countries and genotyped with 1183 SNPs with the GoldenGate® Assay, five panels containing 48, 96, 144, 192 and 384 ancestry informative SNPs (fitted to the plexes of GoldenGate® Assays) were designed to estimate admixture proportions of C-lineage into A. m. mellifera. All SNP panels were able to estimate Clineage admixture proportions highly concordant with those inferred from the 1183 SNP dataset (r≥0.997). The discontinuation of Illumina’s GoldenGate® Assay and the need of a standard method to examine the purity of honey bee populations in a wide geographical area were the motivation to design four multiplexed SNP assays to be genotyped using the iPLEX MassARRAY system, having as a baseline the 144-plex SNP panel. An accurate and cost-effective tool was provided with all genomic information for 117 SNPs for immediate application in genetic surveys and conservation management of A. m. mellifera. The performance of the assays was assessed against the data from 27 Whole-Genome (WG) sequences and using a set of individuals obtained from controlled crosses. In addition, sensitivity tests indicate that this genotyping system has the potential to detect C-lineage introgression at a low frequency (diluted as 1:20 in DNA pools or as 1 F1 hybrid: 7 A. m. mellifera individuals in tissue pools). In contrast with A. m. mellifera, A. m. iberiensis populations exhibit a preserved complex genetic variation pattern. Although neutral processes have played an important role in shaping the Iberian diversity pattern, selection should not be ignored. Therefore, the WGS data of 87 Iberian honey bees were scanned for selection signals using three methods (Samβada, LFMM and PCAdapt) and two datasets (genomic and environmental). Candidate SNPs detected by at least two methods were further examined using a haplotype-based method and protein modelling. Among the 830 SNPs exhibiting selection signals, 90.2% lie in non-coding regions, suggesting that regulatory changes are important in local adaptation. An enrichment of nonsynonymous SNPs was also found, three of them leading to amino acid replacements, within or in the close vicinity of a functionally important site of proteins with functions related to lipids and transmembrane transport. Using both genetic and environmental data, candidate genes putatively under climate-driven adaptation were identified. Interestingly, membrane-related and circadian clock genes, which allow the organism to sense and fine-tune with environmental oscillations, are among the strongest candidate genes. This is particularly important in the context of rapid global change, helping to understand the mechanisms used by organisms to adapt to varying environmental conditions. Likewise for A. m. mellifera, it is important for A. m. iberiensis to have a cost-effective molecular tool capable of accurately detecting C-derived introgression. Reduced assays of highly informative SNPs were developed from 176 WGs. In addition, both the effects of sample size and of sampling a geographically restricted area on the number of highly informative SNPs were tested. Results show that a bias is introduced when the sample size is small (N≤10) and when sampling only captures a fraction of a population’s genetic diversity. The designed assays can be readily used for monitoring populations not only in the native range of A. m. iberiensis but also in the introduced range. Another molecular marker widely used to assess the genetic diversity in honey bees is the mitochondrial intergenic tRNAleu-cox2 region. Using mitogenome data from 123 individuals representing seven subspecies, three lineages (A, M and C) and three African sub-lineages (AI, AII and AIII), it was tested whether the information provided by this region is reliable for historical inference. While the mitogenome analysis supports the three evolutionary lineages defined by the tRNAleu-cox2 intergenic region, it does not support the existence of the three African sub-lineages. Finally, different parts of the mitogenome provided distinct results, implying that the conclusions drawn from studies using only one locus need to be taken with caution. Overall, in this dissertation a set of accurate and reliable tools was developed to be used in the preservation of the genetic integrity of honey bee populations of M-lineage ancestry. Moreover, new insights into genetic basis of Iberian honey bee local adaptation were provided by WGS and environmental data.

A abelha-europeia, Apis mellifera L., exerce um papel essencial no ecossistema como polinizador. No entanto, a sua integridade genética tem sido ameaçada por hibridação introgressiva. Na tentativa de contribuir para contrariar esta tendência esta dissertação tem os seguintes objetivos: (i) revelar a estrutura genética de uma das subespécies mais complexas da Europa, a abelha ibérica (Apis mellifera iberiensis) e (ii) desenvolver ferramentas moleculares para a abelha ibérica e para a abelha-negra (Apis mellifera mellifera), ambas pertencentes à linhagem Europeia Ocidental ou M. Estas ferramentas podem ser usadas tanto em programas de melhoramento como de conservação. A abelha-negra tem sido ameaçada pela hibridação com subespécies da Europa Oriental (linhagem C), como a A. m. ligustica e a A. m. carnica. Usando como base 113 abelhas haploides provenientes de oito países genotipadas com 1183 na GoldenGate® Assay, foram desenvolvidos cinco painéis com 48, 96, 144, 192 e 384 SNPs (adequados para a tecnologia GoldenGate® Assay) com o objetivo de estimar introgressão da linhagem C em A. m. mellifera. Todos os painéis tiveram estimativas de introgressão semelhantes à obtida quando os 1183 SNPs foram usados (r≥0,997). A descontinuação da GoldenGate® Assay e a necessidade de um método para monitorizar a introgressão numa vasta área geográfica motivaram o desenvolvimento de quatro painéis de SNPs apropriados para o sistema iPLEX MassARRAY, tendo como base o painel de 144 SNPs, anteriormente desenvolvido. No final foi divulgada uma ferramenta precisa e económica, juntamente com toda a informação genética dos 117 SNPs, para uma aplicação imediata em estudos genéticos e de conservação da A. m. mellifera. O desempenho deste painel foi avaliado por intermédio de 27 genomas e usando indivíduos obtidos por cruzamentos controlados. Adicionalmente foram efetuados testes de sensibilidade que demonstraram que esta técnica permite a deteção de alelos da linhagem C, mesmo quando em baixas frequências (diluído de 1:20 numa pool de DNA e na proporção 1 F1:7 A. m. mellifera numa pool de tecidos). Contrariamente à A. m. mellifera, as populações de A. m. iberiensis ainda não estão ameaçadas e têm uma estrutura genética complexa. Os processos neutrais tiveram um papel importante na moldagem da diversidade genética, no entanto o papel da seleção não pode ser ignorado. Por isso, foram procurados sinais de seleção usando um total de 87 genomas de abelhas ibéricas, três métodos (Samβada, LFMM e PCAdapt) e dois tipos de dados (genómicos e ambientais). Os SNPs detetados por pelo menos dois destes métodos foram analisados usando métodos haplótipicos e modelação de proteínas. Entre os 830 SNPs com sinais de seleção, 90,2% estão em regiões não codificantes, sugerindo que a regulação tem um papel crucial na adaptação local. Foi também encontrado um enriquecimento de SNPs não-sinónimos, três deles levam à substituição de aminoácidos situados dentro ou perto de locais funcionais de proteínas relacionadas com lípidos e transporte transmembranar. Usando dados genéticos ambientais foram identificados genes relacionados com adaptação a diferentes climas. Curiosamente, os candidatos mais fortes foram genes relacionados com a membrana e o relógio circadiano que permitem que o organismo detete e se adapte a variações ambientais. Estudos de adaptação local são especialmente importantes no contexto das mudanças climáticas, ajudando a perceber quais os mecanismos usados para a adaptação a diferentes condições ambientais. Ferramentas moleculares económicas e precisas para estimar a introgressão da linhagem C são tão importantes para a A. m. mellifera como para a A. m. iberiensis, por isso quatro painéis ultra-reduzidos foram desenvolvidos usando o genoma completo de 176 indivíduos. Adicionalmente, os efeitos do tamanho da amostra e da amostragem geograficamente confinada foram avaliados no número de SNPs fixos. Verificou-se que existe um enviesamento quando o tamanho da amostra é ≤10 e quando a amostragem representa uma pequena porção da diversidade genética. Os painéis ultra-reduzidos podem ser utilizados na monitorização da integridade genética não só na área nativa mas também em locais onde a abelha ibérica foi introduzida. Outro marcador muito usado na avaliação da diversidade genética das abelhas é a região intergénica tRNAleu-cox2 do DNA mitocondrial. Usando dados do mitogenoma de 123 indivíduos de sete subespécies diferentes, três linhagens (A, M e C) e três sublinhagens africanas (AI, AII e AIII), foi testado se esta região é fidedigna para inferência histórica. As análises mitogenómicas suportam as três linhagens evolutivas definidas por essa região intergénica mas não sustentam a existência das três sub-linhagens africanas. É também de salientar que diferentes partes do mitogenoma fornecem diferentes resultados, sugerindo que as conclusões retiradas de estudos que utilizem um só locus devem ser tomadas com precaução. Nesta dissertação foram desenvolvidas ferramentas precisas e fidedignas que podem ser usadas para a preservação da integridade genética das populações europeias de abelhas da linhagem M. Os dados de sequenciação e ambientais ajudaram na compreensão da base genética da adaptação local da abelha ibérica.