Functional characterization of potential SUMO protease targets in Arabidopsis thaliana

Abstract

Unpredictable environmental changes have a negative impact on plant development. To respond to these abiotic and biotic stresses, plants adapted by improving intricate molecular mechanisms, including post-translational modifications (PTMs) that are responsible for modifying proteins and consequently modulating their activity. An important PTM is the fast and reversible attachment of the SUMO peptide, known as sumoylation. It is well reported that sumoylation controls several essential processes in plant development and stress responses. The SUMO attachment is carried out in four steps involving several components such as ubiquitin-like proteases (ULPs), SUMO activating enzyme (E1), SUMO conjugating enzyme (E2) and SUMO ligases (E3). In this pathway, the E1-E2-E3 enzymatic cascade is responsible for the attachment of the SUMO to the target protein. The SUMO proteases ULPs are involved in the maturation of SUMO in an early step of the pathway, but are also responsible for desumoylation or SUMO removal from the target proteins, and therefore for balance of SUMO-conjugate levels. Plant genomes encode for more ULPs than remaining components of the conjugating pathway and, adding to the multitude of phenotypes revealed by ULP mutants, they are considered a source of specificity. However, several plant ULPs lack functional characterization, including ULP2a and ULP2b. Early evidences associated ULP2a and ULP2b with plant developmental regulation and numerous abiotic stress responses. Due to the importance of these proteins, several strategies and molecular tools were developed to study ULP2 function and find possible targets. In the present work SUMO-His fusion transgenic plants were introgressed with ulp2a/b mutant for future functional studies and target purification/determination. Constructs for BiFC assays were produced and tested to study sumoylation dynamics and SUMO-interactions in plants. Finally, plant Pds5 orthologous proteins, named Pds5-Like Members (PLMs) were indicated bioinformatically as potential ULP2s targets, and were used here as a case study. PLM homozygous mutant plants were genotyped, their expression level determined, and they were characterized morphologically and in response to osmotic stress. PLMs were cloned for future protein purification and in vitro desumoylation assays. The present work will aid in the study of ULP2 function and amplify our knowledge about sumoylation in plants.

Alterações ambientais imprevisíveis têm um impacto negativo no desenvolvimento das plantas. Para responder as estes stresses abióticos e bióticos, as plantas adaptaram-se melhorando os seus complexos mecanismos moleculares, incluindo as modificações pós-tradução (PTMs) que são responsáveis pela modificação de proteínas e consequentemente modelação da sua atividade. Uma importante PTM é a ligação rápida e reversível do péptido SUMO, mais conhecida como sumoilação. Na literatura, está bem descrito que a sumoilação controla inúmeros processos no desenvolvimento da planta e na resposta a stresses. A ligação do SUMO ocorre em quarto passos envolvendo diversos componentes como as ubiquitin-like proteases (ULPs), SUMO ativases (E1), SUMO conjugases (E2) e SUMO ligases (E3). Nesta via, a cascata enzimática E1-E2-E3 é responsável pela ligação do SUMO à proteína alvo. As SUMO proteases ULPs estão envolvidas na maturação do SUMO no primeiro passo da via, mas são também responsáveis pela dessumoilação ou remoção do SUMO da proteína alvo, mantendo o equilíbrio dos níveis de SUMO conjugados. O genoma das plantas codificam para mais ULPs do que os restantes componentes da via de conjugação e, acrescentando à multiplicidade de fenótipos revelados por mutantes das ULPs, estas são consideradas uma fonte de especificidade. Contudo, várias ULP de plantas carecem de caracterização funcional, incluindo a ULP2a e a ULP2b. As primeiras evidências associam a ULP2a e a ULP2b à regulação do desenvolvimento da planta e a inúmeras respostas ao stresse abiótico. Devido à importância destas proteínas, várias estratégias e ferramentas moleculares foram desenvolvidas para estudar a função das ULP2 e encontrar possíveis alvos. No presente trabalho foram cruzadas plantas transgénicas contendo construções SUMO-His com o mutante ulp2a/b para futuros estudos funcionais e purificação/determinação de alvos. Foram produzidas e testadas construções para ensaios de BiFC para visualizar interações com SUMO em plantas. Por fim, proteínas Pds5 ortólogas em plantas, denominadas Pds5-Like Members (PLMs), foram identificadas por via bioinformática como potenciais alvos das ULP2s e aqui usadas como caso de estudo. Plantas mutantes homozigóticas nos genes PLM foram genotipadas, sendo determinados os seus níveis de expressão. Foram de igual forma caracterizadas morfologicamente em condições normais e em resposta ao stresse osmótico. Os genes PLM foram clonadas para futuras purificações de proteína e ensaios de dessumoilação in vitro. O presente trabalho auxiliará o estudo da função das ULP2 e assim ampliará o conhecimento sobre a sumoilação em plantas.