Evaluation of immune-determinants associated with resistance-susceptibility to Paracoccidioides brasiliensis: a mouse model perspective

Abstract

Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of paracoccidioidomycosis, one of the most prevalent systemic mycosis in Latin America. Infection by this fungus is thought to be initiated by the inhalation of conidia produced by the saprophytic phase of the fungus. Although many aspects of the host immune response against this pathogen are still unknown, several studies have suggested that macrophages play a key role in the defence against P. brasiliensis. Therefore, our aim is to characterize the macrophage response against strains of P. brasiliensis with different degrees of virulence in order to define the mechanisms required to control infection. To this end, we have established an in vitro model of bone marrow-derived macrophages (BMDM) infection. These cells were infected with P. brasiliensis 18, a highly virulent strain, or P. brasiliensis ATCC60855, a low virulent strain. Here, we show that P. brasiliensis morphology, assessed by scanning electron microscopy, has an important impact in the ability of BMDM to internalize P. brasiliensis. Indeed, while P. brasiliensis ATCC60855, a small strain with a reduced bud number, is easily internalized by BMDM, P. brasiliensis 18, a larger strain with multiple bud cells, is not efficiently internalized. To determine the ability of macrophages to control infection, we assessed the ability of BMDM to control P. brasiliensis growth. We found that, after infection, stimulation of BMDM with interferon (IFN)-γ was not sufficient to activate the production of nitric oxide (NO), a key antimicrobial mediator, and to control P. brasiliensis growth. To define the mechanisms underlying this deficient activation in response to this pathogen, we measured the levels of several cytokines known to activate macrophages and we found that there was a reduced production of tumour necrosis factor (TNF), which was more evident after P. brasiliensis 18 infection. Indeed, it was only after stimulation of BMDM with both IFN-γ and lipopolysaccharide (LPS), a potent inducer of TNF, that these cells were able to produce large amounts of nitric oxide and to control infection. Therefore, our data suggest that P. brasiliensis modulates the signalling pathway that leads to the production of TNF to inhibit the activation of the macrophages fungicidal mechanisms. We also found that the reduced production of TNF by BMDMs is not mediated by interleukin (IL)-10, as both P. brasiliensis strains induced the same levels of IL-10. However, in vivo studies suggest that high levels of IL-10 during infection can be detrimental to the host by modulating the dynamics of the inflammatory response, stressing the importance of the regulation of this cytokine in the balance between protection and pathology during P. brasiliensis infection. Altogether, our data support a model whereby the different induction of TNF by P. brasiliensis strains with different degrees of virulence may underlie the different forms or severity of the disease.

Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, uma das micoses sistémicas mais prevalentes na América Latina. Pensa-se que a infecção por este fungo é iniciada aquando da inalação de conídios produzidos pela fase saprófita do fungo. Embora vários aspectos relacionados com a resposta imune do hospedeiro ainda sejam desconhecidos, estudos sugerem que os macrófagos têm um papel essencial na defesa contra P. brasiliensis. O nosso objectivo é caracterizar a resposta dos macrófagos contra estirpes de P. brasiliensis com diferentes graus de virulência de forma a definir os mecanismos necessários para controlar a infeção. Para isso, estabelecemos um modelo in vitro de infecção de macrófagos derivados da medula-óssea (BMDM). Estas células foram infectadas com P. brasiliensis 18, uma estirpe altamente virulenta, ou com P. brasiliensis ATCC60855, uma estirpe considerada menos virulenta. Através de uma análise por microscopia eletrónica de varrimento, observámos que a morfologia de P. brasiliensis tem um grande impacto na internalização deste fungo pelos BMDM. De fato, enquanto que P. brasiliensis ATCC60855, uma estirpe com células de dimensão reduzida e rodeadas por poucas células-filha, é mais facilmente internalizada, a estirpe P. brasiliensis 18, que é caracterizada por células de maiores dimensões e rodeadas numerosas células-filhas, dificilmente é internalizada. Para determinar a capacidade dos macrófagos para controlar a infecção, avaliamos a capacidade dos BMDM para controlar o crescimento de P. brasiliensis. Descobrimos que, após a infeção, a estimulação destes macrófagos com interferão (IFN)-γ não foi suficiente para activar a produção de óxido nítrico, um mediador chave na resposta microbicida dos macrófagos, nem para controlar o crescimento de P. brasiliensis. Para definir os mecanismos subjacentes a esta activação deficiente, medimos várias citoquinas que são produzidas em resposta â activação de macrófagos e observamos uma diminuição na produção de fator de necrose tumoral (TNF) que foi mais evidente após a infecção com P. brasiliensis 18. Assim, só depois da estimulação dos BMDM com IFN-γ e LPS, um potente indutor de TNF, é que estas células foram capazes de produzir grandes quantidades de óxido nítrico e de controlar a infecção. Desta forma, os nossos dados sugerem que P. brasiliensis modula a via de sinalização que leva à produção de TNF de forma a inibir a activação dos mecanismos fungicidas dos macrófagos. Também observamos que a produção de TNF não é mediada pela interleuquina (IL)-10, já que ambas as estirpes produzem as mesmas quantidades de IL-10 Contudo, estudos in vivo mostram que a IL-10 tem um impacto negativo na dinâmica da resposta inflamatória, o que demonstra a importância da regulação desta citoquina no balanço entre a inflamação e a patologia. Estes dados suportam um modelo no qual a indução de TNF por estirpes de P. brasiliensis com diferente virulência pode ser a base das diferentes formas ou severidade da doença.