Recognition of biomedically relevant ions: design, synthesis and evaluation of novel heterocycle-based unnatural amino acids and short peptides as fluorimetric chemosensors

Abstract

The development of artificial receptors for the recognition of ionic species involved in biological pathways is a topic of great interest as highly selective anion or cation sensing is imperative for many biological and clinical applications. Chemical sensors based on heterocyclic units are unique and useful for molecular recognition because they can act both as recognition and signaling unit, and as these systems are usually highly fluorescent they present advantages like increased sensitivity, lower detection limits and spatial and temporal resolution. In natural amino acids, metallic cations can be complexed through N, O and S donor atoms, at the main and side chains, whereas anion coordination, based on hydrogen bonding and electrostatic interactions, can arise from amino acid side and main chain OH and NH groups. This complexation ability can be enhanced by modifying amino acids with an ion chelating site for stable complex formation with extra heteroatoms in order to exert a cooperative effect for a more efficient binding process. The work presented in this thesis reports the synthesis and characterisation of heterocyclicbased amino acids as well as the evaluation of their photophysical properties having in mind their potential application as fluorescent probes and colorimetric and/or fluorimetric chemosensors for anions and cations, since there is practical interest on the expansion of the body of work published in recent years in the area of unnatural functional amino acids. Therefore, novel unnatural amino acids with enhanced functionalities, such as fluorescence and metal cation and anion recognition ability, were obtained by synthetic manipulation at the side chain of the natural amino acids like phenylalanine, tyrosine, asparagine and glutamine, with the incorporation of sulphur, oxygen and nitrogen heterocycles. The heterocycles used in the present work were (bi)thiophene, furan, pyrrole, imidazole, thiazole, 1,3,4-thiadiazole, 1,2,4-triazole, benzocrown ethers, benzoxazole and benzimidazole, and with these pi-conjugated bridges of heterocyclic nature it was intended to improve the photophysical properties of the resulting systems, and to optimize the recognition of the target analytes by introducing additional binding sites in the overall structure. The novel heterocyclic amino acids were completely characterised by the usual characterisation techniques (proton and carbon nuclear magnetic resonance spectroscopy, UV-Vis absorption and fluorescence spectroscopy, infrared spectroscopy mass spectrometry and/or elemental analysis). The photophysical properties of the synthesised compounds were evaluated in organic solvents of different character and aqueous mixtures, and in some cases related with p* values by Kamlet and Taft. In most cases, the novel compounds displayed very high fluorescence quantum yields, making them good candidates for application as intrinsic fluorescent probes for incorporation in peptidic frameworks, as well as fluorimetric chemosensors. The evaluation of the chemosensory ability of the unnatural amino acids towards organic and inorganic anions, (such as AcO-, F-, Cl-, Br-, I-, ClO4 -, CN-, NO3 -, BzO-, OH-, H2PO4 - and HSO4 -) and alkaline, alkaline-earth, and transition metal cations, (such as Na+, K+, Cs+, Ag+, Cu+, Cu2+, Ca2+, Cd2+, Co2+, Pb2+, Pd2+, Ni2+, Hg2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+ and Cr3+) was carried out by spectrophotometric and spectrofluorimetric titration in acetonitrile and aqueous mixtures. The chemosensing studies revealed that the new amino acids could be used as highly sensitive fluorimetric sensors for Cu2+, Fe3+ and Pd2+. The association constants and the stoichiometry of the formed complexes were calculated by HypSpec software and the stoichiometry was confirmed by Job’s plots. The binding process of the ions was also studied using 1H NMR spectroscopy. Finally, some of the synthesised amino acids were used in the synthesis of short peptide sequences, in order to obtain “proof of concept” regarding the appearance of these amino acids’ intrinsic functionalities (fluorescence and ion recognition ability) in the resulting peptides, as suggested by previous results published within the research group where this work was conducted. Short sequences belonging to the C-terminal of bombesin and melanocortin, as model peptides, were modified by the introduction of some synthesised thiosemicarbazone- and hydrazine-phenylalanines, benzoxazol-alanines and asparagines by substitution of a selected native residue in each peptide model. However, this work on peptide synthesis was not in publishable form at the time of submission of the present thesis but the work is in progress and it is expected that it will be completed in the near future.

O desenvolvimento de recetores artificiais para o reconhecimento de espécies iónicas envolvidas nas vias biológicas é um assunto de grande interesse uma vez que a deteção altamente seletiva de aniões ou catiões é imperativa para muitas aplicações biológicas e clínicas. Os sensores químicos baseados em unidades heterocíclicas são únicos e muito úteis para o reconhecimento molecular, porque podem atuar tanto como a unidade de reconhecimento como a unidade de sinalização, e como esses sistemas são geralmente altamente fluorescentes apresentam vantagens como aumento da sensibilidade, limites de deteção mais baixos e resolução espacial e temporal. Nos aminoácidos naturais, os catiões metálicos podem ser complexados através dos átomos dadores de eletrões como N, O e S, nas cadeias principal e lateral, enquanto que a coordenação de aniões, com base em ligações de hidrogénio e interacções eletrostáticas, pode surgir a partir dos grupos OH e NH nas cadeias principal e lateral. Esta capacidade de complexação pode ser melhorada através da modificação de aminoácidos com uma unidade quelante de iões com heteroátomos adicionais para a formação de um complexo estável, a fim de exercer um efeito cooperativo para um processo de ligação mais eficiente. O trabalho apresentado nesta tese descreve a síntese e caracterização de aminoácidos baseados em heterociclos, bem como a avaliação das suas propriedades fotofísicas tendo em mente a sua potencial aplicação como sondas fluorescentes e sensores químicos colorimétricos e/ou fluorimétricos para aniões e catiões, uma vez que há interesse prático na expansão do corpo de trabalhos publicados nos últimos anos na área dos aminoácidos funcionais não naturais. Assim sendo, novos aminoácidos não naturais com funcionalidades melhoradas, tais como fluorescência e a capacidade de reconhecimento de aniões e catiões, foram obtidos por manipulação sintética na cadeia lateral de aminoácidos naturais como fenilalanina, tirosina, asparagina e glutamina, com a incorporação de heterociclos de enxofre, oxigénio e nitrogénio. Os heterociclos utilizados no presente trabalho foram (bi)tiofeno, furano, pirrole, imidazole, tiazole, 1,3,4-tiadiazole, 1,2,4-triazole, benzoéteres de coroa, benzoxazole e benzimidazole, e com estas pontes pi conjugadas de natureza heterocíclica pretendeu-se melhorar as propriedades fotofísicas dos sistemas resultantes, e optimizar o reconhecimento dos analitos alvo através da introdução de locais de ligação adicionais na estrutura global. Os novos aminoácidos heterocíclicos foram completamente caracterizados pelas técnicas usuais de caracterização (espetroscopia de ressonância magnética nuclear de protão e carbono, espetroscopia de absorção no UV-Vis e de fluorescência, espetroscopia de infravermelho e espetrometria de massa e/ou análise elementar). As propriedades fotofísicas dos compostos sintetizados foi avaliada em solventes orgânicos de diferentes carácter e em misturas aquosas, e em alguns casos, relacionadas com os valores de p* propostos por Kamlet e Taft. Na maioria dos casos, os novos compostos possuem rendimentos quânticos de fluorescência muito elevados, o que os torna bons candidatos para aplicação como sondas fluorescentes intrínsecas para incorporação em sistemas peptídicos assim como sensores químicos fluorimétricos. A avaliação da capacidade quimiossensora dos aminoácidos não naturais face a aniões orgânicos e inorgânicos (tais como AcO-, F-, Cl-, Br-, I-, ClO4 -, CN-, NO3 -, BzO-, OH-, H2PO4 - and HSO4 -) e catiões de metais alcalinos, alcalino-terrosos e de transição (tais como Na+, K+, Cs+, Ag+, Cu+, Cu2+, Ca2+, Cd2+, Co2+, Pb2+, Pd2+, Ni2+, Hg2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+ and Cr3+) foi realizada por titulação espetrofotométrica/fluorimétrica em acetonitrilo e misturas aquosas. Os estudos revelaram que os novos aminoácidos podem ser usados como sensores fluorimétricos altamente sensíveis para Cu2+, Fe3+ and Pd2+. As constantes de associação e a estequiometria dos complexos formados foram calculadas pelo software HypSpec e confirmada por gráficos de Job’s. O processo de ligação dos iões também foi estudado por espetroscopia de 1H RMN. Por último, alguns aminoácidos foram usados na síntese de sequências peptídicas curtas como “prova de conceito” relativamente ao aparecimento das propriedades intrínsecas dos aminoácidos (fluorescência e capacidade de reconhecimento de iões) nos péptidos resultantes. Sequências pertencentes ao C-terminal da bombesina e melanocortina, como péptidos modelo, foram modificadas com algumas tiosemicarbazono- e hidrazono-fenilalaninas, benzoxazolil-alaninas e asparaginas por substituição de um resíduo nativo selecionado em cada um dos péptidos modelo. Não obstante, este trabalho de síntese peptídica não estava em forma publicável na altura de submissão da presente tese mas o trabalho está a decorrer e espera-se que seja concluído num futuro próximo.