Structural studies of succinate acetate transporter and type II NADH dehydrogenase

Abstract

X-ray crystallography is an experimental technique that allows the determination of three-dimensional structure of macromolecules such as proteins, nucleic acids and virus. It involves the crystallization of these biological molecules, X-ray diffraction data collection and processing, crystallographic refinement and model building. Structural biology aims to elucidate the three-dimensional structure of proteins as a way to understand their function. The aim of my work was to encompass most of the methodologies required in X-ray Crystallography, from transformation of targets into an appropriate expression host system to solving the crystallographic structure. This thesis is divided in two main chapters which focus in different parts of the methodologies. In the first chapter it was studied the Succinate-Acetate Transporter (SatP-YaaH), a membrane transporter from Escherichia coli. This transporter belongs to the AceTr family with no known three-dimensional structures reported. To obtain the X-ray structure of this protein several homologous proteins were cloned and the recombinant proteins expressed in E. coli. Of these targets only one was successfully purified through membrane extraction with detergent and chromatographic methods such as Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography and Size Exclusion Chromatography. Crystallization screenings were performed with the purified protein and crystal formation was observed in various conditions. Crystals were sent to a synchrotron light source but diffracted at a maximum resolution of 12 Å. The second chapter focuses in Type-II NADH Dehydrogenase (NDH-II), a monotopic membrane protein of the respiratory chain of Staphylococcus aureus. There are presently three crystallographic structures described in literature but no consensus has been achieved about the catalytic mechanism of this protein. Several crystallization trials were performed with and without substrates and additives. Seeding technics were also attempted. Crystallization of the apo-NDH-II was successful and crystals diffracted to 3.32 Å resolution allowing the structure determination by molecular replacement. Trials with substrates were performed using several techniques and conditions but crystals formed diffracted poorly.

A Cristalografia de Raio-X é uma técnica experimental que permite a determinação das estruturas tridimensionais de macromoléculas, tais como proteínas, ácidos nucleicos e vírus. A técnica envolve a cristalização destas macromoléculas, difração de raios-X, a recolha e processamento dos dados de difração, refinamento e construção do modelo tridimensional. A Biologia Estrutural tem como objetivo a determinação das estruturas tridimensionais das proteínas como modo de compreender a sua função e mecanismos de ação. Este trabalho tem como objetivo englobar o máximo de metodologias usadas em Cristalografia de Raio-X, desde transformação de targets no organismo apropriado para expressão, até a resolver a estrutura cristalográfica. Deste modo esta tese foi dividida em dois capítulos principais que focam em diferentes partes das metodologias. No primeiro capítulo foi estudado o Transportador de Sucinato-Acetato (SatP-YaaH), uma proteína de membrana de Escherichia coli. Este transportador pertence à família de proteínas AceTr, da qual não está descrita nenhuma estrutura tridimensional. Com vista à obtenção da estrutura tridimensional várias proteínas homólogas foram clonadas e expressas em E. coli. Destes targets apenas um foi purificado com sucesso usando extração de membranas com detergente e técnicas cromatográficas tais como Cromatografia de Afinidade com Iões Metálicos Imobilizados e Exclusão Molecular. Testes de cristalização foram realizados com a proteína purificada e a formação de cristais foi observada em várias diferentes. Os cristais foram enviados para sincrotrão e difrataram a uma resolução máxima de 12 Å. O segundo capítulo está focado na NADH Dehydrogenase Tipo-II (NDH-II), uma proteína membranar monotópica da cadeia respiratória de Staphylococcus aureus. Até ao momento existem três estruturas cristalográficas descritas na literatura mas nenhum consenso foi atingido em relação ao seu mecanismo catalítico. Vários testes de cristalização foram realizados com e sem substratos e aditivos. Técnicas de Seeding foram também realizadas. A cristalização da apo-NDH-II foi bem-sucedida e os cristais difrataram a uma resolução 3.32 Å, permitindo resolver a estrutura tridimensional por substituição molecular. Extensos testes de cristalização com substratos foram realizados mas os cristais obtidos difrataram a uma baixa resolução.