Bioengineering Platforms to Modulate the Activity of Smooth Muscle Cells Derived from Progeria-Induced Pluripotent Stem Cells

Abstract

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent today an invaluable tool to create disease cell models for modelling and drug screening. Several lines of iPSCs have been generated in the last 7 years that changed the paradigm for studying diseases and the discovery of new drugs to treat them. In this thesis we focus our attention to vascular diseases in particular Hutchinson-Gilford Progeria syndrome (HGPS or Progeria), a devastating premature aging disease caused by a mutation in the lamin A gene. In general, patients die because of myocardial infarction or stroke at the age of 13. Therefore, in the last 5 years, researchers have used cells derived from iPSCs to model aspects of the HGPS and to screen libraries of chemicals to retard or treat the disease. Smooth muscle cells (SMCs) are the most affected cells in HGPS patients, although the reason for such sensitivity remains poorly understood. Here we developed an in vitro mono-culture cell system to study the vulnerability of HGPS SMCs to arterial flow shear stress using a microfluidic device. HGPS SMCs derived from iPSCs presented similar characteristics observed on progerin-expressing cells and we could recapitulate in vitro the most important aspect of the disease, i.e., HGPS SMCs loss under flow shear stress. The results were also confirmed in SMCs collected from homozygous Lmna G609G/G609G mouse and cultured under arterial flow conditions. Microarray analysis have identified matrix metalloproteinase 13 (MMP13) as a key player for the detachment of SMCs. Finally, Lmna G609G/G609G mice treated with a general MMP inhibitor, batimastat, for 5 weeks showed higher number of SMCs than non-treated animals. To the best of our knowledge, this is the first study documenting part of the mechanism underlining the sensitivity of HGPS SMCs to arterial flow shear stress. In this thesis, we also studied how aged and non-aged SMCs responded to extracellular matrix (ECM), in particular to topographic elements, and if ECM could control the aging of HGPS SMCs. For this purpose, SMCs differentiated from HGPS and normal iPSCs were cultured onto micropatterned and flat substrates during 2 weeks. We showed that microtopography affected differentially cell alignment and nuclear shape in SMCs with and without Progeria. As compared to non-aged SMCs, HGPS SMCs showed impaired alignment to the grooves likely due to their nuclear stiffness. We also demonstrated that micropatterned substrates accelerated the aging process in HGPS SMCs, as confirmed by an increase of progerin and other senescent markers expression, as well as by an accumulation of nuclear envelope proteins SUN1 and Nesprin2. Overall, the results present in this thesis highlight the advantages of using iPSCs to model in a dish HGPS and open new opportunities for the treatment of vascular aging diseases.

As células estaminais com pluripotência induzida (iPSCs) representam hoje uma ferramenta com um valor inestimável para criar modelos celulares de doenças. Nos últimos 7 anos, foram geradas várias linhas celulares de iPSCs, mudando o paradigma no estudo de doenças e descoberta de novos medicamentos para tratá-las. Nesta tese focamos a nossa atenção em doenças vasculares, em particular o síndrome de Progeria de Hutchinson-Gilford (HGPS ou Progeria), uma doença rara caracterizada pelo envelhecimento prematuro causado por uma mutação no gene da lamina A. Geralmente, os pacientes com HGPS morrem com uma idade média de 13 anos devido a enfarte do miocárdio ou acidente vascular cerebral. Por conseguinte, nos últimos 5 anos, os investigadores utilizaram células derivadas de iPSCs para modelar aspetos da Progeria e para o rastreio de bibliotecas de produtos químicos para retardar ou tratar a doença. As células do músculo liso (SMCs) são as células mais afetadas em pacientes com HGPS, embora a razão para tal sensibilidade permaneça pouco compreendida. Nesta investigação desenvolvemos um sistema celular in vitro em combinação com ferramentas de bioengenharia para estudar a vulnerabilidade das HGPS SMCs em condições de fluxo arterial. HGPS SMCs derivadas de iPSCs apresentaram características semelhantes às observadas em células que expressam progerina e, quando cultivadas sob fluxo in vitro, mimetizaram o aspeto mais importante da doença, ou seja, a perda de HGPS SMCs pela tensão de corte do fluxo. SMCs isoladas de ratinhos homozigóticos LmnaG609G/G609G e cultivadas em condições de fluxo arterial também se destacaram do substrato depois de alguns dias de cultura. Após análise genética de microarrays identificamos a metaloproteinase 13 da matriz (MMP13) como um fator principal neste processo de perda das SMCs. Além disso, ratinhos homozigóticos LmnaG609G/G609G que foram tratados com um inibidor de MMPs durante 5 semanas mostraram um número de SMCs mais elevado do que os animais não tratados. Tanto quanto é do nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que revela parte do mecanismo que explica a sensibilidade das HGPS SMCs à tensão de corte do fluxo arterial. Nesta tese, estudamos também a resposta das SMCs envelhecidas e não-envelhecidas à matriz extracelular (ECM), em especial a elementos topográficos, e se o envelhecimento das SMCs pode ser controlado pela ECM. Para este propósito desenvolvemos substratos com padrões na ordem dos micrómetros, e plaqueámos SMCs diferenciada de iPSCs saudáveis e com HGPS. Neste trabalho foi possível mostrar que os substratos com microtopografia afetaram o alinhamento e a forma do núcleo das SMCs com e sem Progeria. Devido à rigidez nuclear, presente nas células com HGPS, o alinhamento destas células ao longo dos substratos foi afetado. Também demonstramos que os substratos com microtopografia aceleraram o processo de senescência em SMCs com HGPS, mas não em SMCs saudáveis. Este fenómeno foi confirmado pelo aumento de progerina e de outros marcadores de senescência, quando as SMCs com HGPS foram cultivadas em substratos com microtopografia. Além disso, o processo de envelhecimento causado pela microtopografia em SMCs com HGPS, afetou a expressão de proteínas do envelope nuclear, SUN1 e Nesprin2, levando à acumulação destas proteínas, tanto nas regiões nucleares como citoplasmáticas. No geral, os resultados presentes nesta tese realçam as vantagens das iPSCs como modelo celular de doenças, abrindo novas oportunidades para compreender o processo de envelhecimento em SMCs e no tratamento tanto de Progeria como de outras doenças relacionadas com o envelhecimento vascular.