Evaluation of bioactivities of a propolis sample (Gerês) of Portuguese origin

Abstract

Propolis is a complex mixture composed by resinous and balsamic material, produced by bees from branches, flowers, pollen, buds and exudates of trees and mixed with bees’ salivary secretions. Bees use propolis in the defense against invaders, protecting the hive from infections resulting from putrefaction. The chemical composition of propolis varies geographically, with the available flora, the climate, the harvesting time and the bee species. Different groups of compounds can be found in propolis extracts, such as flavonoids, phenolic acids and their esters. These compounds have been associated with different biological activities such as antimicrobial; antitumor; antioxidant and free radical scavenger; antigenotoxic and genotoxic; and antimutagenic. The aim of this work relates to the investigation on Portuguese propolis, particularly with regard to its chemical characterization and the evaluation of biological activities of this product in order to assess the possibility of its use/ exploitation in medical applications, cosmeticeutics and nutraceutics. The propolis samples selected for this study were collected in an apiary from Gerês, over four consecutive years and were used to prepare ethanol extracts (EE) which were tested in different assays, using the simple eukaryote S. cerevisiae as biological model. The comet assay was performed to analyze the genotoxicity/ antigenotoxicity and the results suggest that the EE prepared with propolis from Gerês harvested in 2012 (G12.EE) do not display significant genotoxic effect. On the other hand, propolis from Gerês does not protect cells against DNA damages caused by H2O2 either, a behavior displayed by any of the tested extracts (G11.EE, G12.EE, G13.EE e G14.EE). However, cells co- and pre-incubated with G.EE and 10 mM H2O2 displayed higher viability than cells incubated only with H2O2, suggesting that G.EEs protect yeast cells against oxidative stress. The same antioxidant activity was demonstrated by flow cytometry – a lower fluorescence of the intracellular fluorochrome dichlorofluorescein diacetate (H2DCFDA) was detected in cells co- and pre-incubated with G.EE and 5 mM H2O2 as compared with cells incubated only with H2O2 - and corroborated by several other assays in vitro that show the free radical scavenging activity of G.EEs. Antimicrobial activity was evaluated by the agar dilution method and the results suggest that G.EEs have antimicrobial activity, especially against Gram-positive spore forming bacteria. A synergistic effect of G.EEs when mixed with gentamicin was also demonstrated in the present work. The analysis of cells treated with G.EEs in the presence of the fluorochrome rhodamine 123 showed that propolis from Gerês has an influence on the inner mitochondrial membrane potential, decreasing the emitted fluorescence. All the studied propolis samples exhibited a very similar behavior in the different evaluated bioactivities, which in generally is contrary to the variability attributed to this natural product when harvested in different years, even from a single location. For this more constant bioactivities profile possibly contributes the type of standardized production of propolis used by the beekeeper in charge, unlike what makes the great majority of other beekeepers, particularly the Portuguese. A preliminary chemical analysis of G11.EE and G12.EE reveals no significant differences in terms of phenolics profiles, compounds to which the bioactivities of propolis are attributed, thus justifying the more constant behavior evidenced by the four studied extracts.

Própolis é uma mistura complexa formada por material resinoso e balsâmico, produzida pelas abelhas a partir de ramos, flores, pólen, brotos e exsudados de árvores, a qual é misturada com secreções salivares das abelhas. As abelhas utilizam o própolis na defesa contra invasores, protegendo a colmeia de infeções resultantes da putrefação. A composição química do própolis pode variar geograficamente, com a flora disponível, o clima, com a altura da colheita e a espécie de abelha. Diferentes grupos de compostos têm sido identificados em própolis, tais como flavonóides, ácidos fenólicos e os seus ésteres. Estes compostos têm sido associados com diversas atividades biológicas, nomeadamente: antimicrobiana; anti tumoral; antioxidante e quelante de radicais livres; anti-genotóxica e genotóxica; e antimutagénica. O objetivo deste trabalho prende-se com o estudo de amostras de própolis português, particularmente no que diz respeito à sua caracterização química e à avaliação das suas bioatividades, visando a possibilidade da sua utilização/ exploração em aplicações médicas, cosmecêuticas e nutracêuticas. O própolis selecionado para este estudo foi colhido num apiário no Gerês (G), em quatro anos consecutivos, e foi utilizado para preparar extratos etanólicos (EE), que por sua vez foram testados em diferentes ensaios, usando o eucariota simples Saccharomyces cerevisiae como modelo biológico. O ensaio cometa foi realizado para analisar a genotoxicidade/ antigenotoxicidade e os resultados evidenciam que o EE preparado com própolis do Gerês recolhido em 2012 (G12.EE) não apresenta efeito genotóxico significativo. Por outro lado, o própolis do Gerês também não protege as células contra os danos de DNA causados por peróxido de hidrogénio (H2O2), um comportamento exibido por qualquer um dos extratos testados (G11.EE, G12.EE, G13.EE e G14.EE. Contudo, células co- ou pré-incubadas com G.EEs e H2O2 10 mM exibiram maior viabilidade do que células incubadas apenas com H2O2, sugerindo que o propolis protege as células de levedura contra o stresse oxidativo. Esta atividade antioxidante foi também demonstrada por citometria de fluxo - a oxidação do fluorocromo intracelular diacetato de diclorofluoresceina (H2DCFDA) foi menor em células co- ou pré-incubadas com G.EEs e H2O2 do que em células incubadas apenas com H2O2 - e corroborada por outros ensaios in vitro que demonstraram um efeito quelante de radicais livres por parte dos G.EEs. Foi ainda constatado que os G.EEs, embora revelem baixa citotoxicidade para as células eucariotas testadas, têm atividade antimicrobiana particularmente expressiva contra bactérias Gram-positivas produtoras de esporos, tendo sido igualmente observado um efeito sinérgico com o antibiótico gentamicina. A análise de células tratadas com os vários G.EEs, na presença do fluorocromo rodamina 123, mostrou que o própolis do Gerês exerce influência sobre o potencial da membrana mitocondrial interna. Todas as amostras de própolis estudadas exibiram um comportamento muito semelhante nas diversas bioatividades avaliadas, o que de um modo geral contraria a variabilidade atribuída a este produto natural quando colhido em diferentes anos, mesmo que proveniente de um só local. Para este perfil de bioatividades mais constante contribui possivelmente o tipo de produção padronizada de própolis usada pelo apicultor responsável, ao contrário do que faz a grande maioria de outros apicultores, particularmente os portugueses. Uma análise química preliminar de G11.EE e G12.EE, releva não haver diferenças significativas em termos do seu perfil em compostos fenólicos, aos quais se atribuem as bioatividades de propolis, justificando assim o comportamento mais constante evidenciado pelos quatro extratos estudados.