Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/1822/41149

TítuloEngineering a commercial cold-adapted xylanase for improved low pH stability
Autor(es)Santos, Gustavo de Almeida
Orientador(es)Collins, Tony
Johansson, Björn
Palavras-chaveXylanase
Site-directed mutagenesis
Acidophilic adaptation
Hydrophobic interactions
Exposed surface residues
Xilanase
Mutação dirigida
Interações hidrofóbicas
Resíduos superficiais expostos
Adaptação acidófila
Data2015
Resumo(s)Xylan is the main carbohydrate of the hemicellulosic fraction of plant tissues and accounts for one third of all renewable organic carbon available. Xylanases (EC 3.2.1.8), act in nature by catalysing the hydrolysis of xylan molecules into oligomeric and monomeric pentosan units that bacteria and fungi can use as a carbon source. Xylanase producers have been isolated from all ecological niches where plant material accumulates. pXyl, a highly active psychrophilic xylanase, has previously been isolated from the Antarctic bacterium Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a. This cold-adapted xylanase, retains 90 % and 60 % of its activity at 20 ºC and 5 ºC, respectively. It is fully stable (at 25 ºC) between pH 6 and 9 and has maximum activity (>80 % at 25 ºC) between pH 5 and 7.8. At lower pHs irreversible inactivation, protein precipitation and eventually protein unfolding occurs. To study the influence of surface hydrophobic interactions on low pH adaptation and protein precipitation, site-directed mutagenesis and a comparative characterisation of the pH dependency of activity, stability and precipitation of mutant and wild-type enzymes was carried out. In particular, surface hydrophobic residues in an exposed patch as well as neighbouring negative residues were mutated to the polar amino acids serine and/or lysine. Of the 10 mutants prepared, Y43S, V58S and E94S revealed improvements in acid pH stability as compared to the wild-type enzyme, with reduced irreversible inactivation, a maintenance of tertiary structure as monitored by tryptophan fluorescence and increases in the solubility at pH 5 and 5.5 being observed. Y43S and E94S also increased their melting temperature at pH 5 by 2.0 and 0.9 ºC, respectively, whereas for V58S this was decreased 2.2 ºC. It is suggested that specific exposed surface hydrophobes as well as negative residues which display an increased hydrophobicity on protonation at low pHs lead to the increased precipitation of pXyl at acidic pHs. Here we show that substitution of these with the highly polar amino acid serine reduces precipitation and irreversible inactivation.
Xilano é o principal hidrato de carbono da fração hemicelulósica dos tecidos das plantas e corresponde a um terço de todo o carbono orgânico renovável disponível. As xilanases (EC 3.2.1.8), atuam na natureza ao catalisar a hidrólise das moléculas de xilano em unidades oligoméricas e monoméricas da xilose que as bactérias e fungos podem usar como uma fonte de carbono. Vários produtores de xilanase foram isolados de todos os nichos ecológicos onde material vegetal se acumula. pXyl, uma xilanase psicrófila altamente ativa foi isolada na Antártida da bactéria Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a. Esta xilanase adaptada ao frio, retém 90 % e 60 % da sua atividade a 20 °C e 5 °C, respetivamente. É totalmente estável (a 25 ºC) entre pH 6 e 9 e possui uma atividade máxima (> 80 %, a 25 C) entre pH 5 e 7,8. A pHs inferiores a inativação irreversível, precipitação de proteína e desnaturação da mesma ocorrem. Para estudar a influência das interações hidrofóbicas na superfície à adaptação a baixo pH, técnicas de mutagénese dirigida, caracterização comparativa da dependência de atividade, estabilidade térmica, espectroscopia de fluorescência e a precipitação das enzimas mutantes e do tipo selvagem, foram utilizadas. Especificamente resíduos expostos em manchas hidrofóbicas bem como os resíduos negativos vizinhos foram mutados para aminoácidos polares serina e/ou lisina. Cada um dos resíduos investigados foram selecionados a partir de um conglomerado de manchas hidrofóbicas com a presença de resíduos negativos. Dos 10 mutantes preparados, Y43S, V58S e E94S revelaram melhorias na estabilidade a pH ácido, com reduzida inativação irreversível, uma manutenção da estrutura terciária monitorizado por fluorescência do triptofano e aumento na solubilidade a pH 5 e 5,5. Y43S E94S também aumentaram a sua temperatura de fusão em 2,0 e 0,9 °C a pH 5 respetivamente, enquanto que a para V58S esta foi reduzida de 2,2 °C. Sugere-se que resíduos hidrofóbicos expostos na superfície, bem como resíduos negativos que exibem uma hidrofobicidade aumentada aquando da protonação a pH baixos levam ao aumento da precipitação de pXyl a pHs acídicos. Aqui, mostramos que a substituição destes pela altamente polar serina reduz a precipitação e a inativação irreversível.
TipomasterThesis
DescriçãoDissertação de mestrado em Genética Molecular
URIhttp://hdl.handle.net/1822/41149
AcessorestrictedAccess
Aparece nas coleções:DBio - Dissertações de Mestrado/Master Theses
BUM - Dissertações de Mestrado

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