Molecular and physiological approaches towards the characterisation of glycerol transport in Saccharomyces Cerevisiae

Abstract

A adaptação fisiológica de células de Saccharomyces cerevisiae a condições de stresse salino envolve a acumulação intracelular de glicerol como soluto compatível. A concentração citoplasmática de glicerol é regulada permitindo a manutenção do equilíbrio da actividade da água entre o compartimento celular e o meio externo. Em células cultivadas em meios contendo açúcares fermentescíveis, tal como na maior parte dos habitats naturais de levedura, o glicerol é produzido por redução do intermediário metabólico gliceraldeído 3- fosfato, com envolvimento de NADH, e posterior desfosforilação. Uma vez que o cofactor NADH é produzido na glicólise, um mecanismo disponível para a regeneração de NAD+ em condições de anaerobiose é através da síntese de glicerol. Assim, a elevada produção de glicerol é uma consequência fisiológica da fermentação em S. cerevisiae. Este glicerol sintetisado é libertado para o meio, permitindo a sua síntese continuada e regulação permanente do potencial redox. O incremento da síntese de glicerol como resposta a stresse osmótico é mediada pelo aumento da expressão de GPD1, que codifica a enzima glicerol 3- fosfato desidrogenase, e do gene GPP2 que codifica a enzima glicerol 3-fosfato fosfatase. A acumulação é também conseguida por retenção de glicerol através do decréscimo da permeabilidade da membrana citoplasmática. O canal de glicerol Fps1p está envolvido nesta modificação da permeabilidade por um mecanismo de abertura e fechamento do poro. Por outro lado, uma influência na composição lipídica da membrana citoplasmática tem sido atribuída ao gene FPS1, podendo levar à diminuição da permeabilidade ao glicerol. Neste trabalho são apresentados resultados que apontam para a identificação dos genes que codificam os sistemas de transporte activo do glicerol. O gene GUP1, previamente clonado através da dificuldade em utilização de glicerol como fonte de carbono e energia do respectivo mutante, é demonstrado neste trabalho estar envolvido no transporte activo de glicerol. Apesar de em mutantes gup1 ser detectada uma cinética de saturação no transporte de glicerol, apenas em mutantes gup1gut1 a componente de saturação do transporte de glicerol é completamente suprimida. A interferência do primeiro passo do catabolismo de glicerol, catalisado pela enzima glicerol cinase codificada pelo gene GUT1, na determinação experimental de transporte de glicerol em células desreprimidas é coerente com estes resultados. Em células cultivadas em glucose, o transporte activo de glicerol só foi detectado em células incapazes de sintetisar glicerol (fundo genético gpd1gpd2) na presença de stresse salino e de pequenas quantidades de glicerol no meio. Em mutantes com mutações adicionais nos genes GUP1 e GUT1, este transporte continua a ser detectado. Um gene homólogo, posteriormente designado GUP2, foi demonstrado estar envolvido neste transporte uma vez que só se deixou de detectar transporte no mutante gpd1gup1gup2. O envolvimento do transporte activo de glicerol na resposta a stresse osmótico tem sido sugerido por resultados já publicados para os genes GUP1 e GUP2. A análise de expressão por quantificação relativa de mRNA por RT-PCR foi feita para confirmação deste envolvimento. Os níveis de mRNA detectados não foram coerentes com os resultados dos ensaios de transporte activo de glicerol marcado radioactivamente, uma vez que foram relativamente constantes para GUP1 e GUP2. A possibilidade de regulação negativa por parte do glicerol sobre o transporte foi excluída devido à falta de correlação entre os valores de concentração intracelular e os resultados de transporte activo de glicerol. A possibilidade de crescimento sob stresse salino severo de mutantes incapazes de sintetisar glicerol, aponta para a participação da via da dihidroxiacetona na Sumário síntese de glicerol. Esta conclusão é também apoiada na detecção de quantidades significativas deste composto no interior destas células mutantes. O mecanismo de transporte de glicerol pelo canal de glicerol Fps1p foi também investigado neste trabalho devido à incoerência de resultados, publicados previamente, de ensaios de transporte e o tipo de transporte aceite para este sistema. Uma vez que em mutantes fps1 é detectada uma cinética de saturação para a entrada de glicerol apenas em células cultivadas em glucose e colhidas na transição de metabolismo fermentativo para respiratório, uma possível interferência nos ensaios de transporte por desrepressão parcial do gene GUT1 foi postulada. Na pesquisa de um componente saturável na cinética de transporte de glicerol nas condições referidas, apenas em mutantes gut1 não se detectou este componente. Assim, com base nestes resultados e em resultados publicados sobre decréscimo da difusão passiva em mutantes fps1 e na baixa lipossolubilidade da molécula de glicerol, o mecanismo de difusão simples através do canal Fps1p, em oposição à difusão facilitada, é sugerido neste trabalho. Neste trabalho, os mecanismos de transporte transmembranar de glicerol foram estudados e caracterizados. A clonagem dos genes que codificam os sistemas de transporte activo de glicerol foi obtida com o contributo deste trabalho na caracterização dos sistemas de transporte a nível fisiológico e a nível da expressão destes genes, incluindo o envolvimento na resposta a stresse osmótico. O mecanismo de transporte de glicerol pelo canal Fps1p foi elucidado e a difusão simples através da bicamada lipídica da membrana plasmática também foi investigada. Com os resultados obtidos neste trabalho foi possível melhorar o modelo de transporte de glicerol que inclui quatro situações fisiológicas: repressão catabólica, desrepressão, desrepressão parcial e stresse salino. A expressão a nível da transcrição dos genes GUP1 e GUP2 é constante nestas condições e o transporte activo de glicerol só é detectado em células desreprimidas e em células sujeitas a stresse salino desde que incapacitadas de sintesar glicerol. A difusão simples é maioritariamente mediada pelo canal Fps1p e, tal como demonstrado previamente, é abolida sob stresse salino, permitindo retenção intracelular do glicerol.

Physiological adaptation to salt stress of Saccharomyces cerevisiae cells involves intracellular accumulation of the compatible solute glycerol. Regulation of cytosolic glycerol concentration allows maintenance of balanced water activity between the intracellular compartment and the external medium. When cells grow on substrates containing fermentable sugars, as in most common yeast natural habitats, glycerol is produced by NADH-dependent reduction of the glycolytic intermediate glyceraldehyde 3-phosphate and subsequent dephosphorylation. Since a NADH surplus is produced in cells growing under anaerobic conditions, a mechanism to regenerate NAD+ is by glycerol synthesis. Therefore, high glycerol production is a physiologic consequence of anaerobic growth of S. cerevisiae cells. This synthesised glycerol is released to the external medium allowing continuous synthesis of this compound and permanent redox balance. Increased synthesis of glycerol in osmotic stress response is mediated by higher expression of GPD1, encoding the key enzyme of glycerol anabolism, glycerol 3-phosphate dehydrogenase, and of GPP2, encoding glycerol 3- phosphate phosphatase. Accumulation is also achieved by retention of glycerol through a decrease of plasma membrane permeability to glycerol. The glycerol facilitator Fps1p is involved in this permeability modification by a mechanism of opening and closure of the pore. In addition, interference in lipid composition of the plasma membrane, presumably leading to decreased glycerol permeability, has been attributed to FPS1. In this work, strong evidence is presented for the identification of the genes coding the glycerol active uptake systems. The gene GUP1, previously cloned by the impairment to utilise glycerol as carbon and energy source in the correspondent disruption mutants, is demonstrated here to be involved in glycerol active uptake. Despite the fact that in single gup1 mutants a saturable kinetics of glycerol transport was detected, this residual uptake was completelly abolished in the gup1gut1 mutant. An interference of the first catabolic step of glycerol, catalysed by glycerol kinase encoded by GUT1, with experimental determinations of uptake in derepressed cells is consistent with these results. In glucose-grown cells, glycerol uptake is only detectable in mutants unable to synthesise glycerol (gpd1gpd2 genetic background) grown under salt stress in the presence of extracellular glycerol. In addition, further disruptions of gup1 and gut1 did not abolish this uptake. A homologous gene, named GUP2 thereafter, was implicated in the uptake under these conditions since only gpd1gup1gup2 mutant cells did not present this uptake. Evidence pointing to an involvement of active uptake for glycerol in osmotic stress response has been reported for GUP1 and GUP2. Expression analysis by relative quantification of transcripts by relative quantitative RT-PCR was performed in order to further confirm this involvement. Transcript levels did not match with radiolabelled glycerol uptake assays, since nearly constant levels were detected for both GUP1 and GUP2. The possibility of negative feedback regulation of uptake by glycerol was excluded because intracellular levels of this compound did not match with uptake data. Interestingly, gpd1gpd2 mutant strain cells were able to grow under severe salt stress and accumulate significant amounts of glycerol. These results strongly suggest a role in glycerol synthesis by the alternative dihydroxyacetone pathway. The mechanism of glycerol transport by the glycerol facilitator Fps1p was investigated due to inconsistent data concerning the generally accepted mechanism of facilitated diffusion and the glycerol uptake assays reported Rui Oliveira before. Since fps1 mutant cells still presented glycerol uptake according to a saturation kinetics in glucose-grown cells harvested in the diauxic shift, the glycerol facilitation mechanism was questioned and an interference by partial derepression of the glycerol kinase encoded by GUT1 was demonstrated since only gut1 mutants are devoid of this saturable component. Based in these data and in previously reported data concerning decrease of passive diffusion in fps1 mutants together with the low lipossolubility of glycerol, a mechanism of channel for glycerol mediating simple diffusion is presented for Fps1p. In this work, the mechanisms of transmembrane transport of glycerol were further studied and characterised. A contribution was made to clone the gene encoding the glycerol active uptake system and to the characterisation of this transport system, both at physiological and transcript expression levels, including involvement in osmotic stress response. The mechanism of Fps1p-dependent glycerol transport and simple diffusion through the lipid bilayer of the plasma membrane was investigated. Data obtained in this work allowed an improvement of the model for the transmembrane transport of glycerol including four different physiological conditions: under catabolite repression, derepression, partial derepression and salt stress. Expression at transcriptional level of GUP1 and GUP2 is constant in these conditions and active glycerol uptake is detected only in derepressed cells and under salt stress in cells impaired in glycerol synthesis. Simple diffusion is largely mediated by Fps1p and, as demonstrated before, is only abolished under salt stress, contributing to retention of glycerol inside the cell.