Development of Monoolein-based lipofection vectors for therapeutic siRNA delivery

Abstract

A possibilidade de utilizar o mecanismo de RNA de interferência (RNAi) em terapias genéticas constitui um dos grandes avanços científicos do último século. No entanto, apesar do extraordinário potencial terapêutico desta estratégia, a inexistência de um veículo eficiente no transporte do material genético tem atrasado a sua aplicação clínica. O trabalho descrito nesta tese centrou-se no desenvolvimento de um veículo liposomal baseado nos lípidos catiónicos brometo/cloreto de dioctadecildimetilamónio (DODAB/DODAC) e no lípido neutro monooleína (MO), para administração terapêutica de small interfering RNA (siRNA). Pretendeu-se ainda relacionar as propriedades fisicoquímicas dos nanotransportadores com os seus efeitos biológicos. Lipossomas compostos por DODAB/DODAC:MO, com diferentes frações lípido catiónico:lípido neutro, foram comparados relativamente à sua eficiência de encapsulamento e proteção de siRNA em condições fisiológicas; estabilidade; internalização celular; eficiência de silenciamento de um gene alvo; e perfil citotóxico. A organização dos lípidos ao nível molecular foi estudada de forma a compreender os efeitos que os contra-iões (brometo no DODAB e cloreto no DODAC) e percentagem de MO têm na estrutura e toxicidade causada pelos lipossomas. O sistema mais promissor foi otimizado para aplicação sistémica. Lipossomas de DODAB:MO e DODAC:MO apresentaram características adequadas para complexação de siRNA, formando lipoplexos com tamanhos inferiores a 200 nm e carregados positivamente (> +45 mV). Os diferentes contra-iões e percentagem de MO variável afetaram as propriedades dos lipossomas, influenciando a sua internalização, eficiência de silenciamento da proteína eGFP, e toxicidade em várias linhas celulares. Lipossomas de DODAC:MO apresentaram um maior empacotamento a nível da cabeça hidrofílica, maior fusogenicidade, menor tamanho e menor estabilidade em condições fisiológicas, bem como maior toxicidade e menor eficiência de silenciamento, quando comparados com os lipossomas de DODAB:MO. A estratégia de estabilização dos lipoplexos DODAB:MO (2:1), baseada num método de pós-PEGylação com PEG-ceramida, resultou no silenciamento da proteína BCR-ABL e redução da sobrevivência de células de leucemia mielóide crónica. Os resultados apresentados nesta tese de doutoramento validam o potencial da aplicação de lipossomas baseados em monooleína para administração terapêutica de siRNAs.

The possibility of using RNA interference (RNAi) mechanisms in gene therapy was one of the scientific breakthroughs of the last century. But despite the extraordinary therapeutic potential of this approach, the need of an efficient gene carrier is hampering the translation of the RNAi technology to the clinical setting. The main objective of this work was the development of a liposomal nanocarrier, based on the cationic lipids dioctadecyldimethylammonium bromide or chloride (DODAB or DODAC) and the neutral lipid monoolein (MO), for therapeutic delivery of small interfering RNA (siRNA). Establishing a correlation between nanocarriers’ physicochemical characteristics and their biological effects was an additional goal. To achieve this, DODAB/DODAC:MO liposomes, prepared at different cationic lipid:neutral lipid molar ratios, were compared in terms of siRNA encapsulation and protection in physiological conditions, stability, cellular internalization, gene silencing efficiency and associated toxicity. A detailed study of DODAB/DODAC:MO molecular organization was also made to better understand the differences driven by the counter-ions (bromide in DODAB and chloride in DODAC) and MO content on the liposomal structure and toxicity. The most promising system was optimized for systemic administration and knockdown of a therapeutic relevant protein. DODAB:MO and DODAC:MO liposomes with suitable size and surface charge properties for siRNA complexation were obtained, forming small (< 200 nm) and positively charged (> +45 mV) siRNA-lipoplexes. Important effects on liposome properties of the counterions and MO content were observed, affecting cellular internalization, silencing of eGFP protein expression and overall cytotoxicity in different cell lines. DODAC:MO liposomes had a less packed headgroup region, were more fusogenic due to a more homogeneous MO incorporation, formed smaller aggregates and were less stable in physiological conditions than DODAB-based liposomes. Moreover, higher cytotoxicity and lower gene silencing efficiency were observed for DODAC-based liposomes when compared to DODAB-based liposomes. Finally, a successful stealth strategy (post-PEGylation with PEGceramide) was developed for DODAB:MO (2:1) siRNA-lipoplexes, leading to the downregulation of pathogenic BCR-ABL protein and decreased survival of a leukemia cell line. The results presented throughout this thesis validate the potential of MO-based liposomes for therapeutic siRNA delivery.