Staphylococcus epidermidis bacteriophages: new insights on endolysins and phage-biofilm interactions

Abstract

The increasing numbers of healthcare-associated infections are alarming and have resulted in higher morbidity and mortality rates, which ultimately are a burden to the public health systems. Remarkably, it was reported that around 65% of these infections were caused by biofilms. Biofilms are microbial communities attached to a surface and surrounded by exopolymeric substances that form a complex structure. Nowadays it is known that the majority of microbes live within a structured biofilm and not as free-floating organisms. Staphylococcus epidermidis is the most predominant species isolated in central line-associated bloodstream infections and central venous catheter-associated bloodstream infections, and second in surgical site infections. Due to the high tolerance of S. epidermidis biofilms to antibiotics, alternative strategies are required to treat these infections. Currently, the use of bacteriophages (phages) is seen as an important strategy to combat pathogenic organisms. Phages are viruses that specifically infect bacteria and are the most abundant entities on our planet, possessing several advantages for therapy, in comparison with antibiotics. Due to the current advances in phage therapy and the almost absence of virulent phages described that infect S. epidermidis, the purpose of this study was the isolation and characterization of new S. epidermidis-specific phages and the assessment of their suitability for controlling S. epidermidis biofilms. Two different phages were isolated from raw effluents of wastewater treatment plants, phiIBB-SEP1 (SEP1) and vB_SepS_SEP9 (SEP9). Phage SEP1 was shown to have typical features of the Myoviridae genus, Twortlikevirus. This phage was shown to be S. epidermidis-specific, being able to kill all the 41 strains tested and in 4 hours, was able to reduce cell viability around 6-log. Phage SEP9 was shown to possess a set of morphological and genomic features that highlights its uniqueness in comparison to all phages described to date. In vitro experiments showed that besides the presence of an integrase, this phage was unable to lysogenize, presenting a virulent behavior. In addition, SEP9 is characterized by a high lytic spectrum being able to infect 28 out of the 38 S. epidermidis strains tested. Furthermore, the presence of a depolymerase suggests its use for therapeutical purposes. As Twortlikevirus are referred as the best candidates for phage therapy, and SEP1 demonstrated good infective properties, this phage was further used in this study. The efficacy of SEP1 in controlling planktonic and biofilm cells of S. epidermidis was assessed. This phage was highly effective in killing planktonic stationary-phase cells. This rare feature makes it a promising biofilm controller due to the heterogeneous physiology of cells within a biofilm. However, this phage was not able to reduce the number of viable cells of 24 h biofilms neither reduce its total biomass. In order to determine if this inefficacy was a consequence of the metabolic activity of the cells within the biofilm and/or a matter of the biofilm matrix, the efficacy of SEP1 was tested against modulated biofilms with distinct metabolic activities (higher or less proportions of dormant cells). The results showed that distinct metabolic activities did not affect phage efficacy. The reduction of activity against planktonic cells upon addition of biofilm matrix, and the efficacy demonstrated by SEP1 against scrapped biofilm cells suggested that the biofilm matrix hinders phage efficacy. Thus, it was hypothesized that S. epidermidis biofilm matrix confers a protective effect against phage predation most probably due to the interaction of phages with PNAG, limiting their access to the cells. Another goal of this thesis was to provide a deeper knowledge about phage endolysins (lysins), which are phage-encoded peptidoglycan hydrolases that are expressed at the end of the phage infection and are promising antimicrobial agents. For that, a database containing all derived lysins from fully sequenced phages were organized and characterized in silico. New catalytic domains and cell binding domains were encountered and described and a new nomenclature was provided, in order to standardize the annotation of endolysins. Finally, the cloning and expression of the first specific endolysins derived from S. epidermidisspecific phages were attempted. Although several approaches to clone these proteins were tested, they were shown to be difficult to express, having solubility or folding problems. In conclusion, the work described in this thesis contributed significantly to increase the knowledge about S. epidermidis phages and endolysins. Furthermore, new insights on phagebiofilm interactions were obtained, which opens new challenges for this field of research.

O numero crescente de infecções associadas à prestação de cuidados de saúde é alarmante e tem resultado em grandes taxas de morbilidade e mortalidade com avultados custos associados. Uma grande percentagem destas infeções, cerca de 65%, são causadas por biofilmes. Biofilmes são definidos como comunidades microbianas aderidas a uma superfície e envoltas numa matriz exopolimérica, formado uma estrutura tridimensional e complexa. Atualmente reconhece-se que a maioria dos microrganismos vive em biofilmes estruturados e não como células livres. Staphylococcus epidermidis é o principal agente etiológico de infecções da corrente sanguínea associadas ao uso de cateteres e em particular ao cateter venoso central, e a segunda espécie mais isolada em infecções no local cirúrgico. Devido ao facto dos biofilmes desta espécie terem elevada tolerância aos antibióticos, é necessário o desenvolvimento de formas alternativas para tratamento destas infecções. Atualmente, o uso de bacteriófagos (fagos) é visto como uma importante estratégia para combater bactérias patogénicas. Os fagos são vírus que infectam especificamente bactérias e são considerados as entidades mais abundantes no nosso planeta. Estes agentes apresentam várias vantagens terapêuticas quando comparados com antibióticos. Devido aos avanços atuais na terapia fágica e à quase ausência de fagos virulentos descritos que infectam S. epidermidis, o objetivo deste estudo foi o isolamento e caracterização de novos fagos específicos para S. epidermidis e à avaliação da sua adequação para o controlo de biofilmes. Dois fagos diferentes foram isolados a partir de efluentes brutos de estações de tratamento de águas residuais – phiIBB-SEP1 (SEP1) e vB_SepS_SEP9 (SEP9). O fago SEP1 mostrou ter características típicas do género Twortlikevirus pertencente à família Myoviridae. Este fago demonstrou ser específico para S. epidermidis, sendo capaz lisar todas as 41 estirpes testadas. Adicionalmente apresentou a capacidade de, em 4 horas, reduzir a viabilidade das células em cerca de 6 log. O outro fago isolado, SEP9, possui características morfológicas e genómicas que destacam a sua singularidade em relação a todos os fagos descritos até ao momento. Experiências in vitro mostraram que este fago tem um comportamento virulento, não obstante apresentar uma integrase no seu genoma. O espectro lítico alargado deste fago (infecta 28 das 38 estirpes de S. epidermidis testadas), bem como a presença de uma depolimerase sugerem a sua utilização para fins terapêuticos. Por outro lado, como os fagos pertencentes ao género Twortlikevirus são referidos como os melhores candidatos para a terapia fágica, o fago SEP1 foi seccionado para ensaios de infecção em biofilmes. A eficácia do fago SEP1 foi avaliada no controlo de células de S. epidermidis quer em fase planctónica quer em biofilmes. Este fago foi altamente eficaz em matar células em fase estacionária. Esta característica rara faz com que seja um fago promissor para controlo de biofilmes, devido à heterogeneidade fisiológica das células dentro de um biofilme. No entanto, este fago foi incapaz de reduzir a biomassa total de biofilmes de 24 horas e de reduzir o seu número de células viáveis. De modo a determinar se esta ineficácia foi uma consequência da atividade metabólica das células dentro do biofilme e/ou resultado da influência da matriz do biofilme, a eficácia do fago SEP1 foi testada em biofilmes modulados com atividades metabólicas diferentes (maior ou menor proporção de células dormentes). Os resultados mostraram que a eficácia fago não é afetada por atividades metabólicas distintas. A redução da atividade detectada contra as células planctónicas, após adição de matriz de biofilme, bem como a eficácia demonstrada contra as células de biofilmes raspados, sugerem que a matriz do biofilme dificulta a eficácia fago. Assim, admitiu-se a hipótese de que a matriz do biofilme de S. epidermidis confere um efeito protetor contra a predação fágica provavelmente devido à interação de fagos com o PNAG, limitando o seu acesso para as células. Outro objetivo deste trabalho foi aprofundar o conhecimento sobre endolisinas (lisinas) fágicas que são hidrolases do peptidoglicano, expressas no final da infecção fágica e que estão descritas como agentes antimicrobianos promissores. Para isso, foi construída uma base de dados contendo todas as lisinas derivadas de fagos totalmente sequenciados através de dados in silico e todas as lisinas foram anotadas. Este trabalho permitiu a identificação de novos domínios catalíticos e domínios de ligação à parede celular. Adicionalmente, com base nos resultados obtidos foi proposta uma nova nomenclatura para uniformizar a anotação de endolisinas. Finalmente, fizeram-se várias tentativas de clonagem e expressão das primeiras lisinas e depolimerases provenientes de fagos específicos para S. epidermidis. Apesar das várias abordagens utilizadas, as proteínas demonstraram ser de difícil expressão, pela baixa solubilidade ou provavelmente pela dificuldade em adquirir a conformação correta. Em conclusão, o trabalho descrito nesta tese contribuiu significativamente para aumentar o conhecimento sobre fagos de S. epidermidis fagos e endolisinas. Além disso, foram obtidos novos conhecimentos sobre interações fago-biofilme, o que poderá abrir novos desafios para esta área de investigação.