Functional studies on Mycobacterium tuberculosis genetic variability : lactate dehydrogenases

Abstract

Tuberculosis (TB) is a complex disease, ranging from latent to active TB of different severities. Despite the development of modern medicine, TB is still a major health problem, killing approximately 1.4 million people every year. Efforts to develop effective therapeutic strategies to eradicate TB have been hampered by a low understanding of the recently uncovered genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) strains, the causative agents of TB. Evidences for positive selection in MTBC were recently found in specific codon sites of lldD2, a gene with unknown function, currently annotated as a L-lactate dehydrogenase. Therefore, variations in this gene might play a relevant role in the adaptive evolution of some MTBC strains. Interestingly, M. tuberculosis has another gene annotated as a putative L-lactate dehydrogenase, which function is also unknown, and that has less variability. In the in silico part of this study, we investigated different strains from the Mycobacteriaceae family for the existence of lldD1 and lldD2 homologues in their genome, and we verified that all the strains studied presented at least one lldD1 homologue, while only 78.6% of the species presented one lldD2 homologue. Investigating the aminoacidic sequence of the proteins encoded by these genes, we observed that the proteins encoded by lldD2 from all the Mycobacteriaceae species studied contained the active site consensus sequence “S-N-H-G-G-R-Q” of the FMNdependent alpha-hidroxy acid dehydrogenases, the enzyme family that includes the Llactate dehydrogenases. On the other hand, all lldD1 presented a different sequence, “SN- H-G-G-N-N”, which indicates that lldD1 has an incomplete active site. In order to further discover if the function of lldD2 was related with L-lactate metabolism such as in Escherichia coli, we determined the phenotype of an E. coli lldD deletion mutant in different L-lactate concentrations. We also cloned lldD2 in an expression vector, however, we didn't succeed in the protein production, which we believe to be related with codon usage bias . M. tuberculosis growth in different L-lactate concentrations and supplements was also optimized in this study. Overall, the knowledge generated and the laboratorial tools created in this work placed us closer to clarify the function of lldD2 and the relevance of its genetic variability. In the future, this could allow us to better understand the differences between the different MTBC strains and its relevance for disease pathogenicity, possibly informing the development of more effective therapeutic approaches.

A tuberculose (TB) é uma doença complexa, apresentando-se na forma latente ou em formas ativas com diferente severidade. Apesar do desenvolvimento da medicina moderna, a TB continua a ser um problema de saúde grave, matando diariamente cerca de 1.4 milhões de pessoas. Os esforços para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas eficazes na erradicação da TB têm sido dificultados pela falta de conhecimento sobre a diversidade genética recentemente descoberta nas estirpes do Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC), os agentes etiológicos da TB. Evidências de seleção positiva foram recentemente encontradas no MTBC, em codões específicos do lldD2, um gene sem função conhecida atualmente anotado como sendo uma L-lactato desidrogenase. Portanto, variações neste gene podem ter um papel relevante na evolução adaptativa de algumas estirpes do MTBC. Curiosamente, Mycobacterium tuberculosis contém outro gene anotado como L-lactato desidrogenase, que apresenta uma menor variabilidade e cuja função é também desconhecida. Na parte in silico deste trabalho, pesquisamos a existência de homólogos de lldD1 e lldD2 no genoma de diferentes estirpes da família Mycobacteriaceae, e verificamos que todas as espécies estudadas apresentavam pelo menos um homólogo de lldD1, enquanto apenas 78.6% das estirpes continham um homólogo de lldD2. Investigando as suas sequências aminoacídicas, observamos que as proteínas codificadas pelo gene lldD2 de todas as espécies Mycobacteriaceae estudadas continham no seu local ativo a sequência consensus "S-N-H-G-G-R-Q" das alfa-hidroxi ácido desidrogenases dependentes de FMN, a família enzimática das L-lactato desidrogenases. Por outro lado, todos os genes lldD1 apresentavam uma sequência diferente, “S-N-H-G-G-N-N”, o que indica que lldD1 tem um local ativo incompleto. Para descobrir se, tal como em Escherichia coli, a função de lldD2 se relacionava com o metabolismo do L-lactato, determinamos o fenótipo de um mutante de E. coli com deleção de lldD, em diferentes concentrações de L-lactato. Também clonamos lldD2 num vetor de expressão, no entanto não obtivemos sucesso na produção de proteína, que acreditamos estar relacionado com o desvio na utilização de codões observada neste gene. Neste trabalho, otimizamos ainda o crescimento de M. tuberculosis em diferentes concentrações de L-lactato e com diferentes suplementos. No geral, o conhecimento gerado e as ferramentas criadas com neste trabalho colocaram-nos mais perto de clarificar a função de lldD2 e a relevância da sua variabilidade genética. Futuramente, isto poderá permitir-nos compreender melhor as diferenças entre as estirpes do MTBC e o seu papel na patogenicidade da doença, possivelmente estimulando o desenvolvimento de abordagens preventivas e terapêuticas mais eficazes.