Clinical Candida species co-infection and associated virulence

Abstract

The Candida genus consists of approximately 200 species of fungi and collectively represents a highly heterogenic group. Clinically, the most important specie is Candida albicans, an opportunistic fungal pathogen of humans that frequently causes superficial infections of oral and vaginal mucosal surfaces of debilitated individuals. This microorganism is, however, also commonly encountered as a commensal in healthy individuals where it is a component of the normal microflora. Nowadays, non-Candida albicans Candida (NCAC) species such as Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis are also becoming frequently identified as potential human pathogens. Thus, the principal aim of this thesis was to obtain significant insight into the virulence mechanisms of Candida species, with special relevance to those colonising the vaginal tissue, as well as to evaluate their resistance to new antifungal agents. The treatment of human infections caused by Candida (candidosis) is difficult, especially due to the eukaryotic nature of fungal cells. Furthermore, several Candida species exhibit both intrinsic and acquired resistance to common antifungal agents and biofilms produced by Candida are also less susceptible. Thus, the first goal of this thesis was to perform a screening of the antifungal potential of natural plant extracts (Castanea sativa, Filipendula ulmaria, Rosa micrantha and Cistus ladanifer) and four phenolic compounds (gallic acid, catechin, luteolin and quercetin), identified from these plants, against C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis and C. tropicalis. The minimum inhibitory concentration (MIC) of plant extracts and phenolic compounds was determined according to standard methods. The antifungal potential of the phenolic compounds was also tested against Candida biofilms, and was assessed by quantification of colony forming units (CFUs). Overall, all plant extracts, as well as the phenolic compounds, especially gallic acid, revealed promising antifungal activity against Candida species. However, only gallic acid and quercetin demonstrated a slight effect against Candida species biofilms. Although the majority of the studies regarding Candida infection of human mucosal surfaces often include only single species, often candidosis is associated with mixed colonisation. The second aim of this research was to examine the interactions and expression of virulence factors by C. albicans and C. glabrata using a reconstituted human vaginal epithelium (RHVE). The pathogenesis of C. albicans and C. glabrata single and co-infections were investigated using peptide nucleic probe fluorescent in situ hybridization (PNA FISH), confocal laser scanning microscopy (CLSM) and a novel qRT-PCR protocol for Candida quantification in the tissues. RHVE damage was evaluated by measuring lactate dehydrogenase activity. Candida virulence gene (HWP1, ALS, EPA, PLB, PLD and SAP) expression was evaluated by qRT-PCR. It was shown that although C. albicans was a higher coloniser and invader of vaginal tissue, than C. glabrata, the invasiveness of C. glabrata strains was enhanced in the presence of C. albicans. Additionally, the results suggest an important role of HWP1, PLD1 and ALS3 virulence factors in C. albicans and C. glabrata pathogenicity. It is known that several environmental factors may be altered in vivo, to facilitate the conversion of Candida from a harmless commensal to a pathogenic organism. In the vaginal environment, hormonal changes are amongst such influencing factors. Therefore, the effect of progesterone (hormone) in C. albicans biofilm formation and RHVE colonisation and invasion was examined, using the same techniques described above. It was found that progesterone decreased the capacity of C. albicans to form biofilms and it was shown that C. albicans was a higher RHVE coloniser in the absence of progesterone. Gene expression by C. albicans infecting the vaginal epithelium suggests an important role of BCR1 and HWP1 virulence factor in C. albicans pathogenicity. In summary, this work emphasised the importance of studying new natural products as potential antifungal agents and also provided more insight into the mechanisms of vaginal infections caused by Candida species, in mono and mixed cultures, as well as in the presence of progesterone.

O género Candida consiste em aproximadamente 200 espécies de fungos que em conjunto representam um grupo heterogéneo. A espécie clínica mais importante é Candida albicans, um oportunista patogénico para os humanos, que causa frequentemente infeções superficiais da mucosa oral e/ou vaginal em indivíduos débeis. Este microrganismo é, contudo, também comummente encontrado como comensal em indivíduos saudáveis onde é um componente da sua microflora. Contudo, hoje em dia espécies de Candida não Candida albicans (NCAC), como a Candida glabrata, a Candida parapsilosis e a Candida tropicalis começam a ser identificadas como patogénicas. Assim, o principal objetivo desta tese foi obter novos conhecimentos sobre o mecanismo de virulência das espécies de Candida, com especial relevo para a sua colonização do trato vaginal, assim como determinar a resistência a novos agentes antifúngicos. O tratamento de infeções humanas causadas por espécies de Candida (candidíases) é difícil, especialmente devido à natureza eucariota das células fúngicas. Para além disso, muitas espécies de Candida exibem resistência intrínseca e/ou adquirida aos antifúngicos comuns e os seus biofilmes são também menos suscetíveis. Assim, o primeiro objetivo desta tese foi realizar uma avaliação do potencial antifúngico de extratos naturais de plantas (Castanea sativa, Filipendula ulmaria, Rosa micrantha e Cistus ladanifer) e de 4 compostos fenólicos (ácido gálico, catequina, luteolina e quercetina) identificados nessas plantas contra C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis e C. tropicalis. A concentração mínima inibitória (MIC) dos extratos das plantas e dos compostos fenólicos foi determinada seguindo as normas. Para além disso, o potencial antifúngico dos compostos fenólicos foi avaliado em biofilmes de Candida, pela quantificação do número de unidades formadoras de colónias. Globalmente, todos os extratos de plantas e os compostos fenólicos, especialmente o ácido gálico, revelaram potencial antifúngico contra as espécies de Candida. Contudo, só o ácido gálico e a quercetina demonstraram um pequeno efeito contra os biofilmes de Candida. Embora as infeções da superfície das mucosas sejam normalmente estudadas com apenas um microrganismo, sabe-se que em muitas situações as candidíases ocorrem devido a uma infeção mista de Candida. Assim, o segundo objetivo foi examinar as interações e a expressão de fatores de virulência de C. albicans e C. glabrata em infeções simples e mistas, utilizando um epitélio vaginal humano reconstituído (RHVE). Para tal, usaram-se sondas de ácidos nucleicos de hibridação in situ, microscopia de confocal laser e a técnica de PCR em tempo real para a quantificação do número de células de Candida presentes no tecido. O dano do RHVE foi avaliado pela atividade da enzima lactato desidrogenase. A expressão genética (HWP1, ALS, EPA, PLB, PLD e SAP) da virulência da Candida foi avaliada por PCR quantitativo. Então, foi possível verificar que apesar de C. albicans ser muito mais colonizadora e invasora do tecido vaginal, do que a C. glabrata, a invasão das estirpes de C. glabrata aumentou na presença da C. albicans. Para além disso, os resultados obtidos sugerem um importante papel dos genes HWP1, PLD1 e ALS3 na patogenicidade da C. albicans e da C. glabrata. Sabe-se que muitos fatores ambientais podem alterar a facilidade de conversão da Candida de comensal para patogénica. No ambiente vaginal, as hormonas são conhecidas por serem um desses fatores. Por isso, foi avaliado o efeito da progesterona na formação de biofilmes e colonização do RHVE por C. albicans, utilizando as técnicas descritas anteriormente. Assim, mostrou-se que a presença de progesterona diminui a capacidade da C. albicans formar biofilme e colonizar o RHVE. Os resultados da expressão genética sugerem um importante papel dos genes BCR1 e do HWP1 na patogenicidade da C. albicans. Em suma, este trabalho realçou a importância do estudo de novos produtos naturais como potenciais agentes antifúngicos e permitiu ainda alcançar novos conhecimentos no mecanismo das infeções vaginais causadas por Candida, em culturas simples e mistas, bem como na presença de uma hormona.