Development of electrochemical-based methods for antioxidant activity evaluation

Abstract

In the last decades researchers have been studying the importance of antioxidants and in order to do that they have developed methods to evaluate antioxidants capacity / activity as they are of major importance for health and food industry The application of electrochemical techniques for the characterization of antioxidants can bring numerous advantages related to the use of less reagents and the miniaturization of the analytical systems. The present methods for the evaluation of antioxidants capacity / activity are classified according to the type of reaction of the assay, as electron transfer reactions (ET) or hydrogen atom transfer reactions (HAT). In both types of assays, antioxidants are tested in reactions with reactants or radicals that are added or generated in-situ using specific reagents. The characterisation of antioxidants by voltammetric techniques has attracted a growing number of researchers that have demonstrated that electrochemical data provides similar information to the classical ET methods concerning the antioxidants reducing power. The possibility of developing further approaches for the characterization of antioxidants based on electrochemical methods has driven to the present work. In what concerns the characterization of antioxidants by ET-based assays two methodologies are proposed based on direct electron transfer reactions with an anode. The first, denominated by RACE (Reducing Antioxidant Capacity Evaluated by Electrolysis), is based on a coulometric assay. The second consists in the chronoamperometric analysis of antioxidants using microchannel band electrodes devices operating under thin-layer regime. Both methods have the advantage of allowing to characterize antioxidants capacity by the amount of charge that species are able to transfer without the need of calibration steps. The second methodology has further advantages related to the use of small sample volumes and to the short time of analysis. Regarding the characterization of antioxidants by HAT-based assays, it is proposed and demonstrated the suitability of electrogenerated HO radical for this aim. Although the electrogenerated HO radicals by the oxidation of water are well known in the scope of wastewater treatment using anodes as BDD (boron doped diamond), their use in antioxidant assays was not reported. With this purpose it is demonstrated that using a Pt anode it is possible to carry out hydroxylation reactions in galvanostatic electrolysis, as with BDD anodes, although the reactions rates are lower and sensitive to the reactivity of the organics. The possibility of carrying out reactions between electrogenerated HO radicals and electroactive compounds was analysed and the proportion between the rates of the direct oxidation and the mediated by HO radicals was shown to be controlled by means of the electrolyses charge density. The apparent rate constant of consumption of organics by the HO radicals was shown to be related to the species reactivity despite their electroactive nature. A kinetic model that allows the evaluation of the rate constants of reactions between organics and electrogenerated HO radicals is proposed and tested in different circumstances, namely for single species and for mixtures of two organic compounds. The possibility of applying the developed methodology in natural samples was also demonstrated using a commercial green tea-based beverage.

A importância dos antioxidantes tem vindo a ser estudada nas últimas décadas com a finalidade de desenvolver métodos que avaliem a capacidade / atividade dos antioxidantes devido ao papel fulcral que desempenham na saúde e na indústria alimentar. A aplicação de técnicas electroquímicas para a caracterização de antioxidantes pode trazer inúmeras vantagens em relação à menor necessidade de utilizar reagentes e à possibilidade de miniaturização dos sistemas analíticos. Os atuais métodos para a avaliação da capacidade / atividade de antioxidantes são classificados de acordo com o tipo de reação de ensaio , tal como as reações de transferência de electrões (ET) ou reações de transferência de um átomo de hidrogénio (HAT). Em ambos os tipos de ensaios , os antioxidantes são testados em reações com reagentes ou radicais que são adicionados ou gerados in situ, utilizando par isso reagentes específicos. A caracterização de antioxidantes por técnicas voltamétricas tem atraído um número crescente de investigadores que demonstraram que os dados electroquímicos fornecem informações semelhantes aos métodos ET clássicos no que diz respeito à capacidade redutora dos antioxidantes. O presente trabalho surge com a finalidade de criar uma nova abordagem baseada em métodos eletroquímicos para avaliarem e caraterizarem a atividade / capacidade antioxidante. Relativamente à caraterização de antioxidantes baseada em ensaios ET são propostas duas metodologias que se baseiam na transferência electrónica com o ânodo. A primeira, denominada por RACE (Reducing Antioxidant Capacity Evaluated by Electrolysis), é baseada num ensaio coulométrico. A segunda consiste na análise cronoamperométrica de antioxidantes usando um dispositivo de microcanais de bandas de elétrodos que operam sob um regime de camada fina. Ambos os métodos têm a vantagem de permitir caracterizar a capacidade antioxidantes pela quantidade de carga que a espécie é capaz de transferir, sem a necessidade de recorrer a curvas de calibração. O segundo método proporciona ainda vantagens relacionadas com a utilização de volumes pequenos de amostra e ao tempo curto de análise. Relativamente à caracterização de antioxidantes baseada em ensaios HAT, propõe-se o uso de radicais hidroxilo gerados electroquimicamente e demonstra-se a sua aplicabilidade. Apesar de os radicais hidroxilo eletrogerados, como produto da oxidação da água, serem utilizados no âmbito do tratamento de águas residuais usando ânodos como o BDD (boron doped diamond), a utilização destes radicais HO eletrogerados em ensaios de avaliação da atividade antioxidante não foi reportada. Com este objectivo é demonstrado que utilizando um ânodo de Pt é possível realizar reações de hidroxilação em electrólises galvanostáticas, como acontece com os ânodos de BDD, embora as velocidades de consumo serem mais baixas e sensíveis à reatividade dos compostos orgânicos. A possibilidade de levar a cabo reações entre os radicais HO eletrogerados e compostos eletroativos foi analisada e a proporção entre as velocidades de oxidação direta e a mediada por radicais HO foi controlada pela densidade de carga da electrólise. A constante de velocidade aparente relativa ao consumo dos compostos orgânicos por reação com os radicais HO relaciona-se com a reatividade das espécies independentemente da sua natureza eletroativa . Foi proposto e testado um modelo cinético, que permite avaliar as constantes de velocidade das reações entre os compostos orgânicos e os radicais HO eletrogerados. Este modelo foi testado em compostos orgânicos e em misturas de dois compostos orgânicos. A possibilidade de aplicar a metodologia desenvolvida em amostras naturais também foi demonstrada utilizando uma bebida comercial à base de chá verde.