Contribution of the adenine nucleotide carrier, porin, and sphingolipid metabolism to mitochondria membrane permeabilization in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

A decisive event in the cell‟s life-or-death decision is the mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP). The biochemical events responsible for MOMP, considered by many investigators the “point-of-no-return” in cell death, are not entirely defined. Two major and very distinct mechanisms have been implicated in the control of MOMP: i) the action of Bcl-2 family proteins, which can directly engage the outer mitochondria membrane (OMM) and induce the opening of pores; and ii) the mitochondrial permeability transition pore (PTP), an inner membrane unselective channel that induces mitochondria swelling upon long term openings, and eventual rupture of the OMM. The growing interest in cell death biology, fostered by the relevant contributions of yeast to the understanding of basic biological processes, brought the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae into the scene. Yeast cells lack some of the major regulators of apoptosis, such as Bcl-2 family proteins (though one related protein was recently identified), but still possess homologues of mitochondrially enclosed proapoptotic factors, as well as orthologues of the molecular components generally ascribed to PTP, including the ADP/ATP carrier (AAC) and Porin (Por1). These particular features of S. cerevisiae, along with the availability of genetic and molecular tools and easy manipulation, provided an excellent opportunity to study Bcl-2 family members in a “controlled” environment, or the contribution of the PTP and its components to cell death. In this work, the particular contribution of AAC‟s thiol goups, its oxidation, Por1, and of a possible interaction between both proteins to cell death, using the wellestablished model of acetic acid-induced yeast death, was explored. It was observed that the cysteine residues of the Aac2p, when this AAC isoform was individually expressed, do not contribute to the mechanisms of acetic acid-induced death. This finding indicates that the oxidative modifications of Aac2p may not be implicated in the acetic acidinduced cell death program, at least not those involving thiol crosslinking. This idea is supported by the apparent absence of a particular Aac2p oxidation pattern. Nevertheless, the AAC was previously demonstrated to be required for acetic acidinduced cytochrome c release, and its absence promoted the survival of yeast cells. Deletion of Por1, on the other hand, decreased the viability of yeast cells treated with acetic acid. It was hypothesized that the two proteins could share the same pathway in the regulation of cell death. To test this, cytochrome c release was evaluated in mitochondria isolated from Δaac1/2/3, Δpor1 and Δaac1/2/3Δpor1 cells following acetic acid treatment. The data obtained suggest that absence of Por1 does not affect cytcochrome c release, hence MOMP, during acetic acid induced-death, but it may be important for its regulation. When both the AAC and Por1 were absent, yeast mitochondria could still release cytochrome c, raising the possibility of an AACindependent mechanism. Furthermore, we found both proteins have distinct effects that regulate the cellular response to different stresses. Particularly, absence of the AACs somehow contributed to increased cell wall resistance and osmotic stress resistance. Finally, S. cerevisiae was explored as a model to study mechanistic aspects relative to the function of Bcl-2 family proteins. Particularly, we assessed the role of sphingolipids, using cells lacking sphingolipid metabolism enzymes, in the action of the human pro-apoptotic regulator Bax. We found that absence of Isc1p, an inositol phospholipase C that degrades complex sphingolipids into ceramides in yeast, favored the viability of yeast cells expressing an active form of Bax. It was further revealed that this effect is not associated with changes in the action of Bax; rather, it might be related with the cellular consequences of Bax-action. Indeed, a parallel with the effect of Uth1p absence in yeast cells expressing Bax suggests that the absence of Isc1p could affect the selective degradation of mitochondria by mitophagy, and thus produce a different cell death response. This work provides new insights into the physiological events underlying the contribution of mitochondrial proteins, previously associated with cell death responses, and sphingolipid metabolism to cell death induced by acetic acid and Bax, respectively. Once again, the yeast S. cerevisiae proved to be an excellent model in the particular field of cell life and death research.

A permeabilização da membrana mitocondrial externa (MOMP) é considerado o evento decisivo para a sobrevivência celular. Os eventos bioquímicos subjacentes a este processo, considerado o “ponto sem retorno” na morte celular, não estão ainda completamente elucidados. Dois dos principais mecanismos apontados como responsáveis pelo controlo deste processo consistem na acção das proteínas da família Bcl-2, que podem interactuar directamente com a membrana mitocondrial externa induzindo a abertura de poros; e o poro de permeabilidade transitória (PTP), um canal não selectivo que ocorre na membrana mitocondrial interna e que, quando aberto por longos períodos, induz a tumefacção mitocondrial podendo culminar na eventual ruptura da membrana mitocondrial externa. O crescente interesse no estudo da morte celular, potenciado pelas contribuições da levedura na elucidação de processos celulares fundamentais, despoletou a utilização da levedura enquanto modelo para a investigação da morte celular. Os principais reguladores da apoptose, nomeadamente as proteínas da família Bcl-2 (à excepção de um ortólogo recentemente identificado) não estão presentes na levedura. No entanto, este organismo possui ortólogos de vários factores apoptóticos, assim como dos constituintes moleculares do PTP, incluindo o transportador de ADP/ATP (AAC) e a porina de membrana mitocondrial externa (Por1p). Estas características da levedura S. cerevisiae, bem como a disponibilidade de ferramentas genéticas e moleculares aliadas a uma fácil manipulação, fazem deste sistema uma excelente ferramenta para o estudo da expressão de proteínas da família Bcl-2 num ambiente "controlado", ou do contributo do PTP e dos seus componentes para a morte celular. Neste trabalho é estudada a contribuição dos grupos tiol da proteína AAC, e da sua oxidação assim como do papel das próprias proteínas AAC e Por1p, e uma possível interacção entre ambas, para a morte celular induzida por ácido acético. Nas condições testadas observou-se que os resíduos de cisteína do Aac2p, expresso como a única isoforma do AAC, não contribuem para os mecanismos de morte induzida por ácido acético. Este resultado sugere que o programa de morte celular induzido por este composto não depende de modificações oxidativas do Aac2p, pelo menos dependentes da oxidação de grupos tiol. Esta afirmação é suportada por aparente ausência oxidação do Aac2p. No entanto, o AAC já foi previamente descrito como elemento essencial para a libertação de citocromo c da mitocôndria durante a morte celular induzida por ácido acético. Para além deste efeito, a deleção do AAC promove igualmente a sobrevivência das células de levedura. A ausência do gene POR1, por outro lado, diminui a viabilidade deste mutante quando exposto ao tratamento com ácido acético. Em relação a uma possível interação do AAC e da porina Por, foi sugerido que as duas proteínas poderiam partilhar a mesma via na regulação do processo de morte celular em levedura. Para testar esta hipótese, a libertação de citocromo c foi avaliada em mitocôndrias isoladas dos mutantes Δaac1/2/3, Δpor1 e Δaac1/2/3Δpor1 após o tratamento com ácido acético. Os dados obtidos sugerem que a ausência da proteína Por1 não bloqueia a libertação de citocromo c, e consequentemente o MOMP, durante a morte induzida por ácido acético mas pode ser importante para a sua regulação. Na ausência dos genes AACs e POR1 foi possível observar libertação de citocromo c, o que aponta para a existência de um mecanismo alternativo de regulação do MOMP nestas condições. Verificou-se também que estas proteínas têm respostas distintas quando sujeitas a diferentes stresses celulares. Em particular, a ausência dos AAC contribui, de alguma forma, para o aumento da resistência ao stress osmótico e da resistência da parede celular. Por fim, a levedura S. cerevisiae foi usada como um modelo para estudo das proteínas da família Bcl-2. Especificamente, avaliou-se o papel dos esfingolípidos, na acção da proteína pro-apoptótica de mamíferos Bax usando estirpes mutadas no metabolismo dos esfingolípidos. Foi observado que a ausência da proteína Isc1p, uma inositol fosfolipase C que degrada esfingolípidos complexos em ceramidas, favorece a viabilidade de células que expressam uma forma activa da Bax. Mostrou-se ainda que este efeito parece não estar associado a uma alteração na acção da Bax, podendo, pelo contrário, estar relacionado com os defeitos subsequentes à acção desta proteína. Assim, e paralelamente ao que está descrito para ausência da proteína Uth1, a remoção do Isc1p poderá estar a influenciar a degradação selectiva de mitocôndrias através de um processo de mitofagia, conduzindo a um processo diferente na execução da morte celular. Com este trabalho foi possível aprofundar os conhecimentos sobre os mecanismos fisiológicos subjacentes à contribuição de proteínas mitocondriais, anteriormente associadas a processos de morte celular, e do metabolismo de esfingolípidos na morte celular induzida por ácido acético e Bax, respectivamente. Mais uma vez, a levedura S. cerevisiae mostrou-se um excelente modelo para compreensão dos processos de morte celular.