Use of the Comet Assay to study the role of MGMT, MMR and p53 in the repair of alkylating DNA damage

Abstract

Alkylating agents are one a major class of mutagens contributing to DNA damages and carcinogenesis. However, as alkylating agents are powerful inducers of DNA damage related cell death, and are commonly used in the chemotherapy. O6-methylguanine (O6meG) and O6- chloroethylguanine (O6ClethG) are the most cytotoxic lesions caused by Temozolomide (TMZ) and 1,3-bis-(2-chloroethyl)-1-nitrosourea (BCNU), respectively. MGMT (O6-methylguanine-DNA methyltransferase) repair protein directly reverses O6alkylG lesions and, consequently, it is considered as a prognostic marker of resistance in cancer cells exposed to alkylating agents. Therefore, expression levels of this protein predict cancer cell susceptibility and the success of therapy. However, it has been observed that not all tumors with low MGMT activity respond to alkylating agents with increased cell death. Mismatch repair (MMR) system and functional status of p53 are also two most relevant factors in this response. The aims of this project were to study the genotoxic effects of alkylating drugs as detected by the CoMeth assay, and to determine the dependence of a functional MMR system and p53 in the sensitivity of cells to treatment. Thus, using a proliferating MMR-proficient cancer cell line Caco-2, we report that CoMeth assay allows the qualitative evaluation of O6meG lesions as well as O6ClethG, after their conversion to strand breaks. To determine whether the DNA damages (comet assay) and cell death (nuclear condensation assay) induced by (TMZ) and (BCNU) agents are mediated by MMR we used a MMR-deficient colon HCT116 cell line. We observed that even though MMR status seemed to be determinant for cells’ sensitivity to TMZ, this was not applied for the case of BCNU. Resistance to the O6-chloroethylating agent involves other mechanisms that are independent of functional MMR system. We found that induction of DNA damages by BCNU was independent of p53 status, however p53-wt cells showed more pronounced apoptosis compared with p53-null cells. Altogether, our data show that functional MMR system is required for genotoxicity (apoptosis) induced by TMZ. For BCNU, we show that the efficiency on cancer cells is not dependent on the MMR status but only the activity of MGMT. In p53-wt cells, cell death by BCNU was more pronounced. This project also demonstrated the value of the CoMeth assay as a tool for the study of anticancer chemotherapeutic drugs.

Agentes alquilantes são uma das maiores classes de mutagénicos contribuindo para os danos no DNA e para a carcinogénese. Contudo, como os agentes alquilantes são indutores potentes de danos no DNA relacionados com a morte celular eles são frequentemente usados na quimioterapia. O6-metilguanina (O6meG) e O6-cloroetilguanina (O6-cletG) são as lesões mais citotóxicas causadas pela Temozolomida (TMZ) e 1,3-bis-(2-cloroetil)-1-nitrosureia (BCNU), respetivamente. MGMT (O6-metilguanina-DNA metiltransferase) repara a proteína e reverte diretamente as lesões O6-alquilG e, consequentemente, é considerado um marcador de prognóstico de resistência em células cancerígenas expostas a agentes alquilantes. Desta forma, os níveis de expressão desta proteína preveem a suscetibilidade das células cancerígenas e o sucesso da terapia baseada em agentes alquilantes. Contudo, tem sido observado que nem todos os tumores com baixa actividade da MGMT respondem a agentes alquilantes com morte celular aumentada. O sistema de reparação Mismatch repair (MMR – do inglês mismatch repair) e o estado funcional do p53 são também dois dos fatores mais relevantes nesta resposta. Os objetivos deste projeto foram estudar os efeitos genotóxicos de drogas alquilantes, sendo detetadas pelo ensaio do Cometa e determinar a dependência do estado funcional do sistema Mismatch repair e do p53 na sensibilidade às drogas alquilantes. Desta forma, usando uma linha celular cancerígena proliferativa Caco-2, com um sistema MMR eficiente, demonstramos que o ensaio do Cometa permite uma avaliação qualitativa das lesões O6meG bem como as O6-cletG, depois da sua conversão em quebras na cadeia de DNA. Para determinar se os danos no DNA (ensaio do cometa) e morte celular (ensaio de condensação nuclear) induzidos pelos agentes metilantes (TMZ) e cloroetilantes (BCNU) são mediados por reparação MMR usamos a linha celular HCT116 deficiente no sistema MMR. Observamos que apesar do estado MMR parecer ser determinante para a sensibilidade das células à TMZ, este facto não foi observado para o caso do BCNU. A resistência ao agente O6-cloroetilante envolve outros mecanismos que são independentes do sistema funcional MMR. Verificamos que a indução dos danos no DNA pelo BCNU foram independentes do estado do p53, contudo as células com p53 ativo apresentaram uma apoptose mais pronunciada comparado com as células com p53 inativo. De um modo geral os nossos resultados mostram que o sistema funcional MMR é necessário para a genotoxicidade (apoptose) induzidos pela TMZ. Para o BCNU, mostramos que a eficiência nas células cancerígenas não é dependente do estado do MMR mas apenas da actividade da MGMT. Nas células com p53 ativo a morte celular induzida pelo BCNU foi mais pronunciada. Este estudo também demonstrou o papel do ensaio do cometa como ferramenta no estudo de drogas anticancerígenas.