Sistemas de duas fases aquosas ambientalmente sustentáveis para a purificação de DNA plasmídico

Abstract

Os sistemas de duas fases aquosas (SDFA’s) oferecem um grande potencial para a purificação em grande escala de DNA plasmídico (pDNA) para posterior aplicação em terapias moleculares. Estes sistemas baseiam-se na mistura de dois polímeros ou de um polímero e um sal em água, que acima de concentrações críticas formam duas fases distintas que possibilitam a partição diferencial dos compostos adicionados. Considerando as diversas vantagens, que incluem a facilidade de aumento de escala e o baixo custo, destaca-se a operação em contínuo (em macro e microescala) e a elevada capacidade. Neste trabalho, estudou-se a possibilidade de utilização de sistemas de duas fases aquosas ambientalmente sustentáveis para a purificação de pDNA. Testaram-se sistemas polímero-sal e líquido iónico-sal. Foi caracterizado o sistema PEG-citrato de sódio. E observou-se que as curvas binodais obtidas são semelhantes às de outros sistemas PEG-sal bem previamente descritos. A caracterização do sistema permitiu concluir que o efeito de “salting-out” do citrato é fator determinante para a formação e separação das fases. Os estudos de partição e purificação das moléculas de pDNA, presentes no lisado alcalino, permitiram selecionar os sistemas 23% (p/p) citrato de sódio, 20% (p/p) PEG 400 a pH 6,9 e 16% (p/p) citrato de potássio, 36% (p/p) brometo de 1-butil-3-metilimidazólio para posterior purificação num processo multi-estágio. Nestes sistemas, registou-se a acumulação de moléculas de RNA na fase superior. As moléculas de pDNA apresentaram distribuição na fase inferior rica em sal. Apesar de se ter registado a presença de RNA na fase superior destes sistemas, ainda permaneceram moléculas de acido ribonucleico na fase inferior onde também se distribuem as moléculas de plasmídeo. Assim, procedeu-se ao uso de vários estágios para remover a totalidade das moléculas de RNA e dos contaminantes proteicos. Utilizando este processo de multi-estágio obteve-se plasmídeo com elevado grau de pureza na fase inferior. Estes dois sistemas apresentam assim um grande potencial para futura purificação de pDNA em contínuo.

Aqueous two-phase systems (ATPS's) offer a great potential for large scale purification of plasmid DNA (pDNA) for subsequent use in molecular therapies. These systems are based on the mixture in water of two polymers or a polymer and a salt - which above critical concentrations form two phases. This allow the differential partition of compounds between the two phases. These systems presents several advantages that includes easy scale-up, low cost, possibility of continuous operation (at macro and micro scale) and high capacity. In this work it was studied the possibility of using environmental friendly aqueous twophase systems for purifying pDNA. The systems tested were polymer-salt and ionic liquid-salt. The system PEG-sodium citrate was characterized and it was observed that binodal curves obtained were similar to other PEG-salt systems previously described. From the characterization of these systems it was concluded that the effect of "salting -out" of citrate is determinant for the formation and separation of the phases. Partition and purification studies of pDNA molecules, present in the alkaline lysate, allowed the selection of the systems 23% (w/w) sodium citrate, 20% (w/w) PEG 400 at pH 6,9 and 16% (w/w) potassium citrate, 36% (w/w) 1-butyl-3-methylimidazolium bromide for further purification in multi-stage process. In these systems, RNA molecules partitioned to the top phase, while plasmid DNA molecules were distributed in the salt-rich bottom phase. Although it was detected the presence of RNA in the top phase of these systems, some ribonucleic acid molecules remained in the bottom phase. Thus, we proceeded to use several stages to remove all of the RNA molecules and protein contaminants. Using this multi-stage process plasmid was obtained with high purity in the bottom phase. These two systems present though great potential for future purification of pDNA in continuous mode.