Estudo do efeito da pressão na fisiologia de leveduras

Abstract

A utilização industrial de leveduras requer que as células tenham um metabolismo eficiente, com produtividades elevadas, de modo a que a produção de biomassa ou qualquer outro produto seja o mais económica possível. Durante o decorrer de um processo biotecnológico ocorrem variações das condições operacionais, nomeadamente gradientes de pressão de gases, que provocam alterações ao metabolismo celular. Aliado a este factor, está a existência de limitação de oxigénio que ocorre com elevada frequência nos biorreactores industriais. Com este trabalho, pretende-se promover a utilização da pressão moderada para aumentar a taxa de transferência de oxigénio em culturas aeróbias de leveduras em alternativa ao aumento da potência de agitação e do caudal de arejamento. Para tal, foi estudado o efeito da pressão de ar e de oxigénio no comportamento metabólico e fisiológico de leveduras, em particular das leveduras Kluyveromyces marxianus ATCC 10022, Kluyveromyces marxianus CBS 7894 e Candida utilis CBS 621. Foi demonstrado que o aumento da pressão de ar até 6 bar, em cultura descontínua, não inibiu o crescimento das duas estirpes de levedura K. marxianus, influenciando positivamente a formação de biomassa. A diferença encontrada no metabolismo oxidativo do etanol permitiu concluir que o aumento da pressão favorece a assimilação do etanol produzido pelas células da levedura Kluyver negativa (K. marxianus ATCC 10022). Relativamente à estirpe Kluyver positiva para a lactose (K. marxianus CBS 7894), verificou-se que o aumento da pressão total de ar até 6 bar, e consequentemente da taxa de transferência de oxigénio, aumenta consideravelmente a produtividade em biomassa. Com os resultados obtidos, conclui-se ainda que é possível, através da utilização do aumento da pressão de total de ar, conseguir a optimização da produção da enzima β-galactosidase. A tolerância demonstrada pela levedura K. marxianus CBS 7894 à exposição a agentes indutores de espécies reactivas de oxigénio ficou demonstrada pela indução de enzimas antioxidantes como a superóxido dismutase e a glutationa reductase. Embora exista um limite da capacidade de indução, estas enzimas respondem melhor ao aumento da pressão de oxigénio e de ar do que à adição ao meio de cultura de paraquato ou de peróxido de hidrogénio, nas concentrações de 1 mM e de 50 mM, respectivamente. A enzima catalase revelou-se de menor importância na defesa do stresse oxidativo imposto às células. O pré-tratamento com uma pressão de ar sub-letal, 1.2 bar de ar, induziu maior tolerância nas células ao aumento subsequente da pressão de ar e de oxigénio puro. Demonstrou-se que a pressurização do biorreactor, até 6 bar de ar, de culturas de Cândida utilis a operar em semi-contínuo, com concentração celular de 40 g•L-1, não disponibiliza às células oxigénio suficiente para a sua actividade respiratória. Em contrapartida, com a utilização do ar hiperbárico até 12 bar é possível ultrapassar esta limitação, atingindo-se elevadas produtividades em biomassa sem formação de etanol. Este trabalho permitiu demonstrar que, do ponto de vista fisiológico, a utilização do ar hiperbárico até aos valores testados constitui uma alternativa viável a outros métodos de oxigenação de culturas, especialmente em culturas de elevada densidade celular, sem causar danos nas células.

In industrial biomass production, yeasts are required to have an efficient metabolism, with high productivities, in order to achieve an economical production process. During a biotechnological process differences in operational conditions take place, such as pressure gradients, leading to changes in cell metabolism. In a typical industrial cultivation, quite high cell densities are reached and oxygen is usually the major growth limiting factor. The use of pressure in bioreactors may be a way of improving oxygen transfer rate of aerobic cultures avoiding oxygen limitation. The purpose of this research was to study the effects of air and oxygen pressure on the metabolic and physiological behavior of Kluyveromyces marxianus ATCC 10022, Kluyveromyces marxianus CBS 7894 and Candida utilis CBS 621. It was showed that an increase in total air pressure to 6 bar during a batch operation did not inhibit the growth of both yeast strains of K. marxianus and an enhancement of ethanol oxidation was also observed. However, some differences were found between these two strains. K. marxianus ATCC 10022 was a lactose-fermenting strain whereas K. marxianus CBS 7894 had a Kluyver-effect for lactose. On the other hand, increasing the air pressure and lactose concentration resulted in an inhibitory synergistic effect on fermentation with K. marxianus ATCC 10022. Batch cultures of K. marxianus CBS 7894 exhibited an oxidative metabolism for lactose, thus ethanol was never produced. With the increase in air pressure it was possible to increase the biomass productivity of K. marxianus CBS 7894, without damaging the cells. The results indicated that it was possible to use an increased air pressure as an optimisation parameter for β-galactosidase production in high-density cell cultures with Kluyveromyces marxianus strains. The response of Kluyveromyces marxianus CBS 7894 to 50 mM hydrogen peroxide, 1 mM paraquat and increasing air and pure oxygen pressures, were also studied. The effect of these oxidants on the metabolism and the induction of superoxide dismutase, catalase and glutathione reductase were investigated. A greater induction of these antioxidant enzymes by exposure to pressure than to chemicals was observed. Superoxide dismutase and glutathione reductase were preferentially induced rather than catalase. The yeast cells could not cope with pure oxygen pressures values up to 6 bar. However, when cells were previously exposed to sub-lethal air pressures, low enzymatic activity values were found after subsequent exposure to pure oxygen pressure. The pressurisation of a bioreactor with 6 bar of air, did not supply the oxygen needed for a fed-batch culture of Candida utilis CBS 621 growing on sacarose with a cell density of 40 g.L-1. However, this limitation was overcome by increasing air pressure to 12 bar, leading to higher biomass productivity without ethanol production. This work has demonstrated that moderate air pressures, such as that was experimentally applied, can be a good alternative than other oxygenation methods, especially for high cell density cultures.