Genetic diversity and molecular characterization of Saccharomyces cerevisiae strains from winemaking environments

Abstract

The principal aim of the present work is to assess the genetic diversity of fermenting Saccharomyces cerevisiae strains found in vineyards belonging to the Vinho Verde Region in order to create a strain collection representing the region’s biodiversity wealth as a basis for future strain selection and improvement programs. Validation of molecular techniques for accurate genotyping is an indispensable prerequisite for biogeographical surveys. Molecular typing methods (microsatellite analysis, restriction fragment length polymorphism of mitochondrial DNA (mtDNA RFLP), an optimized PCR-based interdelta method and electrophoretic karyotyping) revealed to be substantially equivalent concerning their discriminatory power among 23 commercial S. cerevisiae strains. A large-scale biogeographical survey was devised during the 2001-2003 harvest seasons, comprising three farms, with wineries close to the vineyards, belonging to different sub-regions of the Vinho Verde Region located in northwest Portugal. From 90 grape samples collected, 54 spontaneous fermentations were achieved. The 1620 S. cerevisiae isolates obtained were analyzed by mtDNA RFLP. A high biodiversity was evident by the obtention of 297 different profiles, whereas only 17 profiles showed a wider temporal and geographical distribution, characterized by a general pattern of sporadic presence, absence and reappearance. A representative strain of each profile was further analyzed in six microsatellite loci. Accumulation of small allele-frequency differences across six loci in groups of strains allowed the identification of populational structures. Correlation of genetic differentiation with the distance between sampling points suggested a pattern of isolation-by-distance, where genetic divergence increases with the size of a vineyard. Tracking commercial yeast strains that are used by the wineries since five to ten years revealed to be the adequate experimental model for the environmental risk evaluation associated with the use of genetically modified yeast strains in the wine industry. The presence of commercial yeast strains was evaluated among the 1620 isolates of the present survey. The results were analyzed including data from an identical study performed in three vineyards of the Languedoc Region (south France). Among the 3780 yeast strains identified after spontaneous fermentation, 296 had a genetic profile identical to that of commercial yeast strains. In samples taken at distances from wineries higher than 100 m, less than 2% of the fermentative microflora had a genetic profile identical to that of commercial yeast. In samples taken at very close proximity to the winery and to water rills, the proportion of commercial yeasts increased to 10-43%. The vast majority (94%) of commercial yeasts were found at a distance of between 10 and 200 m from the winery. Commercial strains, despite their intensive annual utilization, do not seem to implant in vineyards, and do not predominate over the indigenous flora, being their presence characterized by natural fluctuations of periodical appearance/dissappearance as autochthonous strains. The data show that dissemination of commercial yeast in the vineyard is limited to short distances and periods of times and largely favoured by the presence of water runoff. Among the 101 recovered natural isolates of strain Zymaflore VL1, three isolates were characterized by loss of heterozygosity (microsatellite analysis), but revealed the same DNA content as the original commercial strain. Wines produced in the Vinho Verde Region are characterized by a high volatile acidity. Gene JEN1 encodes for a monocarboxylate permease in S. cerevisiae, which is subject to glucose repression. As a first approach aiming at the obtention of a genetically modified yeast able to remove acetic acid from grape must, a strain expressing JEN1 in the presence of glucose was achieved.

O presente trabalho teve como principal objectivo a avaliação da diversidade genética de estirpes fermentativas de Saccharomyces cerevisiae na Região dos Vinhos Verdes no sentido de estabelecer uma colecção de leveduras, que representa a biodiversidade da região, como recurso para futuros programas de selecção e melhoramento de estirpes enológicas. A validação de métodos moleculares para genotipagem é um pré-requisito essencial para estudos biogeográficos. Neste sentido, foi realizada a análise de 6 loci de microsatélites, dos perfis de restrição de DNA mitocondrial (mtDNA RFLP), cariotipagem e de um método optimizado baseado na amplificação de sequências interdelta num conjunto de 23 estirpes comerciais de S. cerevisiae. Os métodos revelaram idêntico poder de discriminação, tendo-se obtido 21 perfis distintos, embora a cariotipagem tenha permitido distinguir uma das 3 estirpes que não foram diferenciadas pelos outros métodos. Tendo em linha de conta a principal directriz enunciada para este trabalho de tese, foi realizado um estudo biogeográfico em larga escala, em três quintas pertencentes a sub-regiões da Região Demarcada dos Vinhos Verdes de 2001 a 2003, com a adega localizada nas proximidades da vinha. Recolheram-se 90 amostras de uva, 54 das quais iniciaram a fermentação espontânea, permitindo a obtenção de 1620 isolados de S. cerevisiae. A elevada biodiversidade de estirpes fermentativas foi demonstrada pela obtenção de 297 perfis de mtDNA RFLP, dos quais apenas 17 apresentaram maior distribuição geográfica e temporal. Uma estirpe representativa de cada um dos 297 perfis de mtDNA RFLP foi analisada em 6 loci de microsatélites. A acumulação de pequenas diferenças nas frequências alélicas no conjunto dos 6 loci permitiu a identificação de estruturas populacionais em grupos de estirpes das diferentes vinhas. A correlação entre a distância dos pontos de amostragem com a diferenciação genética sugere um padrão de isolamento por distância em função do tamanho da vinha. O rastreio de estirpes comerciais utilizadas consecutivamente nos últimos 5 a 10 anos nas adegas acima mencionadas, constituiu um modelo experimental adequado para a avaliação de riscos ambientais associados ao uso de leveduras geneticamente modificadas na produção de vinhos. A presença de estirpes comerciais foi pesquisada nos 1620 isolados do presente trabalho. Os resultados obtidos foram analisados incluindo 2160 isolados provenientes de um estudo paralelo realizado em três vinhas da Região Languedoc (Sul de França). De entre os 3780 isolados, 296 apresentaram um perfil genético idêntico às estirpes comerciais utilizadas. Verificou-se uma incidência reduzida de leveduras comerciais (< 2 %) na flora fermentativa de uvas colhidas a uma distância superior a 100 m da adega. A partir de amostras mais próximas da adega e de riachos, a proporção de leveduras comerciais situava-se entre 10-43%, sendo que a maior parte (94%) foi encontrada em locais distanciados 10 a 200 m da adega. O conjunto de dados permitiu concluir que leveduras comerciais, apesar da sua abundante utilização anual, não permanecem nas vinhas e possuem um perfil de aparecimento/desaparecimento semelhante ao da flora indígena, não dominando a flora indígena. A sua disseminação está associada a distancias curtas por tempo limitado, sendo a água um factor importante. Três dos 101 isolados da estirpe Zymaflore VL1, recuperados de vinhas em proximidade da adega, apresentaram perda de heterozigosidade para 6 loci de microsatélites, tendo no entanto o mesmo teor de DNA que a estirpe comercial original. Vinhos produzidos na região dos Vinhos Verdes são caracterizados por uma elevada acidez volátil. Em S. cerevisiae o gene JEN1 que codifica para um sistema de transporte de ácidos monocarboxílicos está sujeito a repressão catabólica pela glucose. Como primeira abordagem para a obtenção de uma levedura geneticamente modificada, capaz de remover com eficácia ácido acético em mostos de uva, foi obtida uma estirpe que apresenta actividade para este sistema de transporte na presença de glucose.