New heterocyclic bioactive fluorescent compounds: spectroscopic studies of DNA interactions and encapsulation in nanoliposomes

Abstract

Spectroscopic studies (absorption and steady-state fluorescence) of potential antitumoral heteroaryl and heteroannulated indoles, benzothienopyran-1-ones, methyl 3-amino-6-heteroarylthieno[3,2-b]pyridine-2-carboxylates, tetracyclic thieno[3,2-b]pyridine derivatives and benzothienoquinolines, synthesized in our research group, were performed in solvent of different polarities. Generally, all the compounds presented a solvent sensitive emission with significant red-shifts in polar solvents, pointing out for their potential use as solvatochromic probes. The antitumoral potential of some of the compounds was evaluated by the growth inhibition of human tumor cell lines in collaboration with the Faculty of Pharmacy of the University of Porto. The spectroscopic properties of the compounds were also evaluated when incorporated in liposomes of neat lipids and lipid mixtures of different formulations, including, Egg-PC (egg yolk phosphatidylcholine), DPPC (dipalmitoyl phosphatidylcholine), DPPG (dipalmitoyl phosphatidylglycerol), DMPG (dimyristoyl phosphatidylglycerol), DOPE (dioleoyl phosphatidylethanolamine), DSPE-PEG (Distearoyl phosphatidylethanolamine-polyethylene glycol), DODAB (Dioctadecyldimethylammonium bromide) and cholesterol. Fluorescence steady-state anisotropy measurements allowed monitoring the location and behaviour of the compounds in the liposomes. In most cases, they showed to be located mainly in the hydrophobic region of the lipid bilayers, experiencing differences in fluidity between the rigid gel and the liquid-crystalline phases. These studies of the antitumoral compounds encapsulation were made having in mind future drug delivery applications. The mean size, size-distribution and zeta-potential of the liposomes incorporating the most promising antitumoral compounds, were determined by DLS (Dynamic Light Scattering). Almost all the liposomes with the incorporated compounds have shown diameters under 165nm and, with some formulations like DPPC:DMPG:DSPE-PEG (1:1:0.1), small diameters (below 100nm), low polydispersity and reasonable negative zeta-potential values were obtained for two of the methyl 3-amino-6- heteroarylthieno[3,2-b]pyridine-2-carboxylates studied. In order to evaluate the interaction with nucleic acids, the binding modes of the tetracyclic planar fluorescent thieno[3,2-b]pyridine derivatives and of the benzothienoquinolines to salmon sperm DNA and/or to synthetic double-stranded (ds) heteropolynucleotides were studied using spectroscopic methods which allowed the determination of intrinsic binding constants (Ki) and binding site sizes (n). Fluorescence quenching experiments with iodide ion were also performed in order to distinguish between the different binding modes of the compounds to the nucleic acids studied, since intercalated molecules are less accessible to anionic quenchers due to electrostatic repulsion with negatively charged nucleic acids. All the compounds interact with DNA and polynucleotides either by intercalation or groove binding. The latter seems to be the main type of interaction of these compounds with nucleic acids.

Foram realizados estudos espetroscópicos (absorção e fluorescência em estado estacionário) de heteroarilindoles e indoles heteroanelados, benzotienopiran-1-onas, 3-amino-6-heteroariltieno[3,2-b]piridina-2-carboxilatos de metilo, derivados tetracíclicos de tieno[3,2-b]piridinas e benzotienoquinolinas com potencial antitumoral, sintetizados no nosso grupo de investigação, em solventes de diferentes polaridades. De um modo geral, todos os compostos apresentaram uma emissão sensível ao solvente com significativos desvios para vermelho em meios polares, indicando a sua potencial utilização como sondas solvatocrómicas. O potencial antitumoral de alguns dos compostos foi avaliado através da inibição do crescimento de linhas celulares tumorais humanas em colaboração com a Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto. As propriedades espetroscópicas foram também avaliadas para os compostos incorporados em lipossomas de lípidos puros e misturas lipídicas de diferentes formulações, incluindo, Egg-PC (fosfatidilcolina do ovo), DPPC (dipalmitoilfosfatidilcolina), DPPG (dipalmitoilfosfatidilglicerol), DMPG (dimiristoilfosfatidilglicerol), DOPE (dioleoilfosfatidiletanolamina), DSPE-PEG (Distearoil fosfatidiletanolamina-polietilenoglicol), DODAB (Brometo de dioctadecildimetilamónio) e colesterol. Medidas de anisotropia de fluorescência em estado estacionário permitiram monitorizar a localização dos compostos nos lipossomas. Na maioria dos casos, os compostos mostraram estar localizados maioritariamente na região hidrofóbica da bicamada lipídica, sentindo diferenças de fluidez entre a fase-gel e a fase líquidocristalina dos lípidos. Estes estudos de encapsulação dos compostos antitumorais foram realizados tendo em vista aplicações futuras de libertação de fármacos. O tamanho médio, distribuição de tamanhos e potencial-zeta dos lipossomas incorporando os compostos antitumorais mais promissores foram avaliados através de medidas de DLS (Difusão de Luz Dinâmica). A maioria dos lipossomas mostrou possuir diâmetros menores que 165nm e, algumas formulações como DPPC:DMPG:DSPE-PEG (1:1:0.1), exibiram tamanhos menores que 100nm e baixa polidispersividade. Valores de potencial-zeta razoavelmente negativos foram obtidos para dois dos 3-amino-6- heteroariltieno[3,2-b]piridina-2-carboxilatos de metilo estudados. Para avaliar a interação com os ácidos nucleicos, os modos de ligação dos derivados tetracíclicos fluorescentes planares de tieno[3,2-b]piridinas e de benzotienoquinolinas ao DNA de esperma de salmão e heteropolinucleótidos sintéticos de cadeia dupla, foram estudados usando métodos espetroscópicos que permitiram a determinação das constantes de ligação (Ki) e tamanho dos sítios de ligação (n). Medidas de inibição de fluorescência pelo ião iodeto foram também realizadas para distinguir entre os diferentes modos de ligação dos compostos aos ácidos nucleicos estudados, uma vez que as moléculas intercaladas estão menos acessíveis a inibidores aniónicos devido às repulsões eletrostáticas com os ácidos nucleicos carregados negativamente. Todos os compostos interatuam com o DNA e polinucleótidos ou por intercalação, ou por ligação nos sulcos (grooves). Este modo de ligação parece ser o tipo de interação predominante dos compostos com os ácidos nucleicos.