Bioactive compounds recovery from Larrea tridentata leaves and their potential benefits for human health

Abstract

Plants are one of the most important sources of compounds with biological properties of great interest to human health. Larrea tridentata (Sessé & Moc. Ex DC.) Coville (Zygophyllaceae), commonly known as gobernadora or creosote bush, is a plant that grows in semiarid areas of Southwestern United States and Northern Mexico. This plant was traditionally used for centuries by North American Indians to treat a wide range of medical conditions and illnesses including genitor-musculoskeletal urinary and respiratory tract infections, inflammation of the system, damage to the skin, kidney problems, arthritis, diabetes and cancer, among other diseases. Among several valuable bioactive phenolic compounds present in L. tridentata leaves, the natural occurring lignan nordihydroguaiaretic acid (NDGA) has been pointed out as the most important, presenting antioxidant, antiviral, antimicrobial, and antitumorgenic activities. Other important bioactive compounds, such as kaempferol (K) and quercetin (Q), are also present at considerable high concentrations in this plant. Extraction of bioactive compounds from plants is conventionally performed by heat-reflux method. Nevertheless, different techniques including ultrasound-assisted extraction, microwave-assisted extraction, supercritical fluid extraction, and accelerated solvent extraction have been developed in order to decrease the extraction time, as well as the solvent consumption, increasing the extraction yield and enhancing the extracts quality. Solid-state fermentation (SSF) is another interesting technology that can be used for the extraction and/or production of plant metabolites, able to provide extracts with both high quality and biological activity, while precluding any toxicity associated to the use of organic solvents. Based on the reasons mentioned before, the main purpose of this thesis was to recover bioactive compounds from L. tridentata leaves and evaluate their potential benefits for human health. The research consisted of a sequence of tasks, which started by the study of the nordihydroguaiaretic acid recovery by microwave-assisted extraction technique. The maximum recovery of bioactive compounds was determined under specific conditions of solvent concentration, solid-liquid ratio and extraction time. In the sequence, SSF was evaluated as an environmentally friendly alternative method for the extraction of bioactive compounds from L. tridentata leaves. Finally, some studies were performed with the objective of verifying the effects of the produced extracts for human health. The antibacterial activity of the crude methanolic extract and fractions (hexane, dichloromethane ethyl acetate, and ethanol) from L. tridentata leaves, as well as of the pure NDGA against different bacteria species were studied. The cytotoxic activity of the crude methanolic extract, fractions and pure compounds from L. tridentata leaves against human cancer cell lines was also determined. This work revealed that microwave-assisted extraction using methanol as extraction solvent was a faster and more efficient method for NDGA recovery from L. tridentata leaves when compared to the conventional heat-reflux method. Methanol in a concentration of 90% (v/v) was the most efficient organic solvent to recover bioactive compounds (NDGA, kaempferol and quercetin) from L. tridentata leaves by solid-liquid extraction, comparing with other solvents used (ethanol, acetone and distilled water). This plant has the particularity of having a high content of lignin (approximately, 36% w/w), but when submitted to SSF with the fungus Phanerochaete chrysosporium (which has ability to degrade lignin), neither a significant liberation nor an improvement of chemical extraction of NDGA, K and Q occurred. However, some increase of the total phenolic, flavonoids and protein contents in the extracts were obtained after the plant fermentation. In terms of biological properties of the produced extracts, crude methanolic extract and fractions, in particular ethyl acetate and dichloromethane fractions showed promising results concerning antibacterial and cytotoxic activities, respectively. Further toxicological and pharmacological studies will be useful to confirm the hypothesis of using phytochemicals from L. tridentata leaves.

As plantas são uma das principais fontes de compostos com propriedades biológicas de grande interesse para a saúde humana. Larrea tridentata (Sessé & Moc. Ex DC.) Coville (Zygophyllaceae), vulgarmente conhecida por gobernadora ou creosote bush, é uma planta que cresce nas áreas semi-áridas no Sudoeste dos Estados Unidos da América e norte do México. Esta planta era tradicionalmente usada durante séculos pelos povos indígenas norte-americanos para o tratamento de diversas condições médicas e doenças, como infecções do sistema urinário e respiratório, inflamações gerais, problemas de pele e rins, artrite, diabetes, cancro, entre outras. Entre vários compostos fenólicos bioativos de valor acrescentado presentes nas folhas de L. tridentata, o ácido nordihidroguaiarético (NDGA) que surge naturalmente nesta planta é um lignano ao qual se atribui importantes atividades biológicas como, por exemplo, atividade antioxidante, antiviral, antimicrobiana e antitumoral. Outros compostos bioativos presentes nas folhas da L. tridentata em concentrações consideráveis e com notáveis atividades biológicas são o kaenferol (K) e a quercetina (Q). A extração de compostos bioativos de plantas é convencionalmente realizada por um sistema de aquecimento com refluxo. No entanto, diferentes métodos, incluindo extração assistida por microondas e ultra-som, extração com fluído supercrítico, e extração acelerada por solvente, entre outros, têm sido desenvolvidos com o objetivos de diminuir o tempo de extração e o volume de solvente usado, aumentar os rendimentos de extração e melhorar a qualidade dos extratos. A fermentação em estado sólido (FES) é uma outra tecnologia interessante que pode ser usada na extração e/ou produção de metabolitos de plantas capazes de proporcionar extratos com elevada qualidade e atividade biológica, evitando o uso de solventes orgânicos potencialmente tóxicos. Com base nas razões anteriormente mencionadas, o principal objetivo desta tese foi a recuperação de compostos bioativos de folhas de L. tridentata e avaliação dos potenciais benefícios desses compostos e extratos para a saúde humana. O trabalho de investigação consistiu numa sequencia de tarefas, iniciando-se pelo estudo da recuperação de NDGA através da técnica de extração assistida por microondas. O valor máximo recuperado de compostos bioativos foi determinado sob condições específicas de concentração de solvente, relação sólido-líquido e tempo de extração. Em sequência, foi avaliada a fermentação em estado sólido como técnica alternativa e ecológica para a extração de compostos bioativos de folhas de L. tridentata. Finalmente, alguns estudos foram realizados no âmbito de verificar o efeito de extratos produzidos na saúde humana. Para isso foi estudada a atividade antibacteriana de extrato metanólico bruto de folhas de L. tridentata, de diversas frações deste mesmo extrato (hexano, diclorometano, acetato de etilo e etanol), e do composto NDGA puro, contra diferentes espécies bacterianas. A atividade citotóxica destas amostras, frente a várias linhas celulares cancerígenas, foi igualmente determinada. Através deste trabalho foi possível comprovar que a extração assistida por microondas usando metanol como solvente foi mais rápida e eficiente na recuperação de NDGA de folhas de L. tridentata quando comparada com a técnica convencional de aquecimento com refluxo. Metanol a 90% (v/v) demonstrou ser o solvente orgânico mais eficiente para a extração de compostos bioativos (NDGA, kaenferol e quercetina) de folhas de L. tridentata por extração sólido-líquido, comparativamente a outros solventes (etanol, acetona e água destilada). Esta planta possui a particularidade de possuir uma concentração elevada de lignina (aproximadamente, 36 % p/p) mas quando submetida a FES com o fungo Phanerochaete chrysosporium (reconhecido pela sua capacidade de degradar lignina), não se observou uma libertação ou recuperação química significativas de NDGA, K e Q. No entanto, verificou-se um aumento nas concentrações de fenólicos totais, flavonóides e proteínas nos extratos obtidos após FES do material vegetal. Em relação às propriedades biológicas dos extratos produzidos, o extrato bruto metanólico e frações, em particular a fração de diclorometano e acetato de etilo demonstraram resultados promissores no que diz respeito a atividade antibacteriana e citotóxica, respectivamente. Outros estudos toxicológicos e farmacêuticos são necessários de modo a confirmar a hipótese de usar os fitoquímicos de folhas de L. tridentata.