High-performance thin-layer chromatography detection of globotriaosylceramide in urine samples : improvement of the method and sampling

Abstract

Fabry disease (FD) is a lysosomal storage disorder caused by deficient or null production of the enzyme α-galactosidase A (α-Gal A) as a result of mutations in α-galactosidase A gene (GLA), located on the X chromosome. The systemic accumulation of α-Gal A substrates, which are excreted in urine, leads to progressive damage of several organs and tissues and ultimately results in death due to heart failure, renal failure and cerebrovascular accidents. Many studies are focused in diagnosing FD through measurement of α-Gal A activity in blood and of accumulated substrates, mainly globotriaosylceramide, in plasma or urine. Mass spectrometry techniques are extensively used for screening of FD and other lysosomal storage disorders. However, mass spectrometry is an expensive method, requires a specialized operator and involves complex equipment. Thin-layer chromatography, on the other hand, is a robust and well explored method suitable for analysis of a large number of samples. The collection of urine samples is easy and non-invasive, which facilitates the cooperation of the subjects, but urine samples are difficult to transport without degradation. In this study, the problematic of urine samples transport was overcome by using filter paper as a supporting material that allows shipping through general mail without deterioration. The high-performance thin-layer chromatography method conventionally used to analyse Gb3 in urine samples was successfully optimised to analyse urine in filter paper. Using this method 60% of the previously diagnosed FD patients revealed increased Gb3 levels and one patient on enzyme replacement therapy showed significant Gb3 reduction after three months of therapy. The developed screening method offers an easy and simple method for urine sample shipping without degradation and suitable for a mass screening and ERT follow up program.

A doença de Fabry (FD) é uma doença lisossomal de sobrecarga causada pela atividade deficiente da enzima α-galactosidase A (α-Gal A) do, como resultado de mutações no gene desta enzima (gene GLA), localizado no cromossoma X. A acumulação sistémica dos substratos da α-Gal A, que são excretados na urina, leva à lesão progressiva de vários órgãos e tecidos, conduzindo por fim à morte devido a falência cardíaca, falência renal e acidentes vasculares cerebrais. Vários estudos estão debruçados no diagnóstico da doença de Fabry através da medição da atividade da α-Gal A em sangue e de substratos acumulados, principalmente o globotriaosilceramida, em urina e plasma. As técnicas de espectrometria de massa são extensivamente no rastreio da doença de Fabry e outras doenças lisossomais de sobrecarga. Contudo, a espectrometria de massa é um método dispendioso, requer um operador especializado e envolve equipamentos complexos. A cromatografia em camada fina, por sua vez, é um método robusto e bem explorado adequado à análise de grandes grupos de amostras. A colheita de amostras de urina é fácil e não é invasiva, o que facilita a cooperação por parte dos dadores, mas as amostras de urina são difíceis de transportar sem que haja deterioração. Neste estudo, a problemática do transporte de amostras de urina foi ultrapassada utilizando o papel de filtro como material de suporte, permitindo que as amostras sejam enviadas por correio normal sem degradação. O método de cromatografia em camada fina de alta performance convencionalmente utilizado na análise de Gb3, em amostras de urina, foi otimizado com sucesso para analisar amostras de urina em papel de filtro. Recorrendo a esta metodologia, verificou-se que os níveis de Gb3 estavam aumentados em 60% dos doentes de Fabry previamente diagnosticados, e que um paciente em terapia enzimática de substituição mostrou uma redução significativa de Gb3 após três meses de terapia. O método de rastreio desenvolvido oferece um modo simples e fácil de envio das amostras de urina sem que haja degradação, sendo por isso, adequado para o rastreio em massa e seguimento dos pacientes em terapia.