Development of a method for extraction and characterization of the proteins associated with extracellular matrix in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

In tissues of multicellular organisms, the extracellular space is filled by extracellular matrix (ECM), which maintains the tissue architecture and allows the relative spatial location of cells so that there is diffusion of nutrients, oxygen, and signaling molecules, thus mediating communication between individual cells. The main components of the ECM are complex sugars (GAGs) and proteins such as collagen. The yeast colonies and biofilms have been revealed as structured groups of cells in which the relative position determines how these cells grow and die. The morphology of these structures, as well as the survivability of a good part of the cells involved, depends on the formation of support structures for accessibility to nutrients and water. In eukaryotes, this happens because the cells are connected by an MEC intervenient in differentiation and long range cell signaling interaction. The composition of yeast MEC is essentially unknown, although it is pointed to the existence of a complex mixture of sugars and proteins. The gene GUP1, belonging to the family of membrane proteins O-acyl transferases, is a pleiotropic gene whose function is involved in a variety of physiological processes of the cell. In particular, cells that lack this gene revealed a composition, stability and morphology cell wall defective, and a profound change of lipid composition and function of the plasma membrane. These phenotypes, among others, lead to loss of ability to adhere and invade, with concomitant alteration of cellular differentiation capacity, and are reflected macroscopically in the morphology of multicellular structures such as colonies and biofilms, which depend on the composition of the ECM. This work allowed the development and optimization of a simple and easily reproducible ECM extraction method in S. cerevisiae and characterization of its components. The application of the method to strains in wild and lacking GUP1 allowed the comparison of the secreted protein profile (secretoma) and isolate the proteins of interest for later identification.

Em tecidos de organismos multicelulares, o espaço extracelular é preenchido por matriz extracelular (MEC), que mantém a arquitectura tecidular e permite a localização espacial relativa das células de modo a que haja difusão de nutrientes, oxigénio e moléculas sinalizadoras, deste modo mediando a comunicação entre as células individuais. Fazem parte da composição da MEC açúcares complexos (GAGs) e proteínas como o colagénio. As colónias e biofilmes de leveduras têm vindo a ser reveladas (tal como nos Eucariontes complexos) como grupos estruturados de células em que a posição relativa das células determina como estas crescem e morrem. A morfologia destas estruturas, bem como a capacidade de sobrevivência da maioria das células envolvidas, depende da formação de estruturas para acessibilidade a nutrientes e água, isto acontece porque as células estão ligadas por uma MEC que intervém na diferenciação, interacção e sinalização celular. A composição da MEC de leveduras é essencialmente desconhecida. O gene GUP1 pertence á família das proteínas de membrana O-acil transferases. É um gene pleiotrópico cuja função está envolvida numa variedade de processos fisiológicos da célula. Nomeadamente, a delecção deste gene revela uma composição, estabilidade e morfologia defeituosa da parede celular, e ainda uma alteração profunda da composição lipídica e funcionalidade da membrana plasmática. Estes fenótipos, entre outros, levam à perda de capacidade de aderência e invasão, e por isso de capacidade de diferenciação celular, e reflectem-se, macroscopicamente, na morfologia das estruturas pluricelulares como as colónias e os biofilmes, que dependem da composição da MEC. Este trabalho, permitiu o desenvolvimento e optimização de um método simples e facilmente reprodutível de extracção de MEC de S. cerevisiae e caracterização dos seus componentes. A aplicação do método às estirpes selvagem e deleccionada em GUP1 permitiu a comparação do perfil proteico segregado (secretoma) e isolar as proteínas de interesse para uma posterior identificação.