The role of ceramide in acetate-induced apoptosis in colorectal carcinoma cell lines

Abstract

Colorectal carcinoma (CRC) is the third most common malignant neoplasia worldwide and one of the leading causes of cancer death in Europe. In this context the finding of new therapeutic approaches is of prime importance to fight these types of cancers. Ceramide is an evolutionarily conserved second messenger capable of regulating vital cellular functions including cell growth, differentiation, senescence and apoptosis among others. Due to the importance of this molecule a lot of research has been done, in the past few years, to elucidate how the levels of ceramide can be modulated in cancer cells in order to overcome chemoresistance and induce apoptosis. The Propionibacteria from specific dairy products are able of surviving in human intestine producing short chain fatty acids (SCFA), particularly acetate and propionate. Acetate is able to induce apoptosis in CRC cells and more recently it was reported by our laboratory that upon acetate treatment, LMP and release of cathepsin D occurred in CRC cells undergoing apoptosis. It was also shown that ceramide can activate and release cathepsin D into the cytoplasm. However the involvement of ceramide in the apoptosis induced by acetate in CRC to the best of our knowledge was never investigated. The present study aimed to address the possible involvement of ceramide generation in acetate-induced cell death in CRC cell lines (RKO and HCT-15). We study cell viability and apoptosis in cells treated with C2-ceramide as well as the cell viability of cells co-treated with acetate and ceramide synthesis inhibitors: Desipramine (a sphingomyelinase pathway inhibitor) or Myriocin (a ceramide de novo synthesis pathway inhibitor). Our results confirm that C2-ceramide induces cell death by apoptosis in CRC cell lines. Upon treatment of both cell lines with ceramide inhibitors we observed that RKO cells were more sensitive to Desipramine at high concentrations than HCT-15 cells. Co-treatment with Myriocin or Desipramine and acetate failed to reduce the cytotoxicity of acetate, suggesting that neither the sphingomyelinase synthesis pathway, by the action of acid SMase, nor the ceramide de novo synthesis pathway is involved in acetate-induced apoptosis in CRC cells. In summary, the results confirm that ceramide induce apoptosis in HCT-15 and RKO cell lines but further studies, using all the inhibitors of the ceramide generation pathways, are needed to better clarify the involvement of ceramide in acetate-induced apoptosis in CRC cells.

O cancro colorrectal (CRC) é a terceira neoplasia maligna mais comum em todo o mundo e uma das principais causas de morte por cancro na Europa. Neste contexto, a descoberta de novas abordagens terapêuticas é primordial para combater este tipo de cancro. A ceramida é um mensageiro secundário evolutivamente conservada capaz de regular funções celulares vitais, incluindo o crescimento celular, diferenciação, senescência e apoptose entre outros. Devido à importância desta molécula muitas pesquisas têm sido efetuadas, nos últimos anos, para elucidar como é que os níveis de ceramida podem ser modulados em células do cancro a fim criar novas estratégias de forma a de superar a quimiorresistência e induzir a apoptose nestas células. As Proprionibacterias, encontradas em produtos lácteos específicos, são capazes de sobreviver no intestino humano e produzem ácidos gordos de cadeia curta (SCFA), em particular acetato e propionato. O acetato é capaz de induzir apoptose em linhas celulares de CRC tendo sido recentemente relatado que após o tratamento com acetato ocorre LMP e liberação de catepsina D em células de CRC que estão a sofrer apoptose. Foi demonstrado que ceramida pode ativar e liberar catepsina D para o citoplasma. O papel da ceramida na morte celular induzida pelo acetato no CRC a nosso conhecimento nunca foi investigado. O objetivo do presente estudo foi avaliar o possível envolvimento de geração de ceramida na morte celular induzida por acetato em células do CRC (RKO e HCT-15). Estudamos a viabilidade celular e apoptose de células tratadas com C2-ceramida e assim como a viabilidade celular de células co tratadas com acetato e inibidores de ceramida: Desipramina (inibidor da via de esfingomielinase) ou Miriocina (inibidor da via de novo). Os nossos resultados confirmam que a C2-ceramida induz morte celular por apoptose nas células de CRC. Após o tratamento de ambas as linhas celulares com os inibidores observamos que as células RKO são mais sensíveis à Desipramina em altas concentrações do que as células HCT-15. O co-tratamento com acetato e Miriocina ou Desipramina não levou à redução da citotoxicidade do acetato, sugerindo que nenhuma das vias de síntese de ceramida estudadas (via esfingomielinase pela ação da SMAse ácida nem a via de de novo) está envolvida na morte celular induzida pelo acetato nestas células. Em suma, os nossos resultados confirmam que a ceramida induz apoptose nas linhas celulares de CRC HCT-15 e RKO contudo, estudos adicionais com os restantes inibidores das vias de síntese de ceramida são necessárias de modo a poder confirmar ou negar o envolvimento da ceramida na apoptose induzida por acetado nas células do CRC.